免疫PCR[ImPCR,ImmunoPCR]基本原理、試驗程序和操作方法4
3 PCR產物的檢測與定量技術 1）凝膠檢測系統 用凝膠掃描儀或計算機輔助視頻設備對溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行定量，放射性標記的擴增產物可通過放射自顯影定量測定，最近用自動DNA 測序儀檢測熒光標記的核酸，這種方法可準確測量擴增產物的大小，而且其檢測靈敏度達fg水平，但由于自動DNA序列儀和熒光標記引物極為昂貴，所以現在僅用于研究。 2）HPLC檢測系統此法的優點為PCR產物不用純化，對未標記的產物靈敏度可達fg水平，對標記產物的檢測限度可能更低。HPLC能區分不同分子的大小，可允許我們使用不同大小的內標衡量擴增的效率。 3） 固相測定系統最常用的為96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用儀器比色或讀數，可用親合素分子通過疏水相互作用包被滴定板，此固相系統可特異結合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR產物的定量，如用生物素和地高辛雙重標記的擴增產物可用微量滴定板法定量，將生物素和地......閱讀全文
免疫PCR[ImPCR,－Immuno－PCR]基本原理、試驗程序和操作方法4
3 PCR產物的檢測與定量技術 1）凝膠檢測系統 用凝膠掃描儀或計算機輔助視頻設備對溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行定量，放射性標記的擴增產物可通過放射自顯影定量測定，最近用自動DNA 測序儀檢測熒光標記的核酸，這種方法可準確測量擴增產物的大小，而且其檢測靈敏度達fg水平，
免疫PCR[ImPCR,－Immuno－PCR]基本原理、試驗程序和操作方法2
4DNA和PCR系統 免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應用了PCR強大的擴增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質性，盡可能不選用受檢樣品
免疫PCR[ImPCR,－Immuno－PCR]基本原理、試驗程序和操作方法3
3)抗原抗體反應:用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫(～22℃)下45min，洗板孔15次×10min，去除未結合的抗體分子。4)鏈親合一蛋白A結合反應:每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫(～22℃)50min，使得嵌
免疫PCR[ImPCR,－Immuno－PCR]基本原理、試驗程序和操作方法1
一、定義；免疫PCR是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術。用抗體檢測抗原是免疫學的最基本方法，用酶或同位素標記抗體可使檢測的敏感性提高，常用的定量檢測方法ELISA和RIA均基于標記分子可以使檢測的信號增強。免疫PCR是在ELISA的基礎上建立起來的新方
免疫PCR(ImmunoPCR)概念和基礎
（一） 免疫PCR技術的概念免疫PCR是一種抗原檢測系統，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規方法檢測PCR產物。免疫PCR集PCR的高靈敏度與抗體和抗原反應的特異性于一體。其突出的特點是指數級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢出濃度低至2ｎｇ
免疫PCR技術（ImmunoPCR）
免疫PCR技術（Immuno-PCR）?免疫PCR方法（Immuno-PCR）是Takeshi等1992年將免疫學反應和PCR技術相結合而創建的一種新的檢測技術，具有抗原、抗體反應的特異性和PCR技術的高效性。它運用PCR的高度敏感性來放大抗原抗體反應的特異性，使實驗中只需數百個抗原分子即可檢測，甚
免疫PCR(ImmunoPCR)概念、組成和免疫PCR產物的檢測
（一） 免疫PCR技術的概念免疫PCR是一種抗原檢測系統，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規方法檢測PCR產物。免疫PCR集PCR的高靈敏度與抗體和抗原反應的特異性于一體。其突出的特點是指數級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢出濃度低至2ｎｇ
什么是免疫PCR(immunoPCR)？
1.定義：免疫-PCR(immuno-PCR)它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統。主要步驟有三個:①抗原-抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質粒DNA)。?2
什么是免疫PCR(immunoPCR)？
1.定義：免疫-PCR(immuno-PCR)它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統。主要步驟有三個:①抗原-抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質粒DNA)。?2
免疫PCR(IMPCR)注意事項
免疫PCR(IM-PCR)注意事項???? (1)固相載體的選擇：主要取決于抗原在固相載體上的吸附程度。如果抗原吸附良好，可以進行IM-PCR。如果抗原吸附不良，則需選用雙抗體夾心IM―PCR。另外選用的固相載體要和PCR儀器相匹配。一般用0.5ml的塑料反應管，也可以用微量滴定板。???? (2)
免疫PCR(immunoPCR)技術的定義及特點介紹
1.定義：免疫-PCR(immuno-PCR) 它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測。是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統。主要步驟有三個:①抗原-抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質粒DNA)。?
PCR技術導論、實驗條件和試驗程序(2)
2.2.2.3 操作程序1．在無菌的Eppendorf管內加入以下反應物：2．93℃ 反應2 min后開始以下循環： 93℃變性反應1 min； 50℃退火反應1 min； 72℃延伸反應3 min。 經過17～35循環后，最后一個循環72℃增加5 min。循環結束后反應產物置于40
PCR技術導論、實驗條件和試驗程序(1)
1 導論多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）是美國 Perkin-Elmer/Cetus公司人類遺傳研究室Mullis K. B.等人于1985年發明的一種快速體外DNA片段擴增技術，是八十年代分子生物學資源領域的一項革命性突破，被譽為分子生物學資源
免疫PCR的基本原理
??? 免疫PCR的基本原理1.定義??免疫PCR（immuno polymerase chain reaction,IM-PCR）是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術。該技術把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結合起來，利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的
PCR反應程序
1．常規程序將 PCR 反應所需的成分配置完后，在 PCR 儀上于 94-96℃ 預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板 DNA 充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般 50-60℃ 之間），一般保持 30 秒鐘，使引物與模板
PCR反應程序
1．常規程序將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb
引物TM值和PCR程序問題
tm值和引物中的GC含量有關 只要相差不是太大就行 設定時取平均值就可以；你可以根據引物的長度和GC的百分比來確定一下哪個更準確。不知道你用的那個公司的機器，一般是的在退火溫度后面的空格里，輸入你每個循環升或降的溫度，后面還有加減號代表升或降。
反向PCR(reverse－PCR)原理、程序和局限
反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有
直接原位PCR（In－situ－PCR）操作方法
原位PCR是原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結合的技術，使得靶基因檢測有了極大的改進。此技術是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。1．組織切片和細胞樣品的制備【試劑與配置】10%福爾馬林二甲苯PBS【
PCR基因擴增儀的原理和程序
??PCR技術即基因擴增技術。?? ? PCR基因擴增儀擴增DNA的原理是：先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴增的DNA片
免疫PCR
免疫PCR ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量
免疫PCR
免疫PCR (Immuno PCR, Im-PCR) 是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術。是用一段已知DNA分子標記抗體作為探針，用此探針與待測抗原反應，PCR擴增粘附在抗原抗體復合物上的這段DNA分子，電泳定性，根據特異性PCR產物的有無，來判斷待測
PCR實驗操作程序
1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：反應物 加樣順序 體積(μl) 終濃度去離子水 1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L?MgCl2 4 3 1.5mmol/L有義引物 5 2.6 0.25μmol/L反義引物
PCR實驗操作程序
1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣： 反應物 加樣順序 體積(μl) 終濃度 去離子水 1 29.4 10×Buffer B 2 5 1× 4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L MgCl2 4 3 1.5mmol/L 有義引物 5 2.6 0.
PCR實驗操作程序
1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：反應物 加樣順序 體積(μl) 終濃度去離子水 1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L MgCl2 4 3 1.5mmol/L有義引物 5 2.6 0.25μmol/L反義引物
PCR反應程序如何設定
程序：94℃預變性 5~10min94℃變性30s~2min退火 30s~2min72℃延伸1~5min72℃延伸5~10min中間三步循環，具體時間依自己的模板和引物情況而定。
標準的Touchdown－PCR程序
ANNEALING TEMP. 55度94 5min94 30s60 30s72 1min 2cycles94 30s59 30s72 1min 2cycles94 30s58 30s72 1min 2cycles........94 30s51 30s72 1min 2cycles94 30s50
Overlap－PCR（重疊PCR）的基本原理
Overlap?PCR（重疊PCR）重疊PCR的應用是非常廣泛的，他的原理其實很簡單：比如說有兩個基因或者說一個啟動子和一個基因，你要將他們連接到一 起，我們首先想到的方法當然是借助于酶切的方法，但有時我們并不一定能構找到合適的酶切位點，或者說我們找到了酶切位點，但這種酶非常特殊或者又很貴，我 們可
PCR技術的程序和一般過程
試劑(1)引物:決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同,選用不同引物,每種病原微生物都有自己特異的引物。(2)耐熱的DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫90℃-100℃。(3)10×PCR緩沖液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)
免疫PCR試驗方法全解析
*、材料與方法【生物素標記特異性抗體的制備】? 免疫球蛋白的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結合的Biotin-hydrazide作生物素標記。? ① 將純化的抗體(IgM或IgG，0.1~1.0ml)在標記緩沖液(0.1Mol/L NaAc，pH值5.5，0.1Mol/L NaCl)中4℃透