3 PCR產物的檢測與定量技術
1）凝膠檢測系統
用凝膠掃描儀或計算機輔助視頻設備對溴化乙錠染色的瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠進行定量，放射性標記的擴增產物可通過放射自顯影定量測定，最近用自動DNA
測序儀檢測熒光標記的核酸，這種方法可準確測量擴增產物的大小，而且其檢測靈敏度達fg水平，但由于自動DNA序列儀和熒光標記引物極為昂貴，所以現在僅用于研究。
2）HPLC檢測系統此法的優點為PCR產物不用純化，對未標記的產物靈敏度可達fg水平，對標記產物的檢測限度可能更低。HPLC能區分不同分子的大小，可允許我們使用不同大小的內標衡量擴增的效率。
3）
固相測定系統最常用的為96孔聚苯乙烯微量滴定板，可用儀器比色或讀數，可用親合素分子通過疏水相互作用包被滴定板，此固相系統可特異結合生物素或生物素化的分子可用于生物素化的PCR產物的定量，如用生物素和地高辛雙重標記的擴增產物可用微量滴定板法定量，將生物素和地高辛同時標記PCR產物的方法有三種途徑:①在反應混合物中同時加入地高辛和生物素標記的脫氧核苷酸類似物(DIG-/Bio-dUTP);②加入生物素化的引物1和DIG-dUTP;③加入生物素引物1和地高辛標記的引物2。定量方方法為:雙重標記的擴增產物用乙醇沉淀以去除未結合的標記物，然后加至親合素包被的微量滴定板上溫育至少2小時，洗滌數次后，與DIG抗體:AP結合物溫育，根據其底物不同可產生不同的顏色，親合素介導的固相捕獲生物素標記靶分子的技術是一個有效、靈活和容易操作的技術，將成為定量PCR的一個關鍵技術。
4）SPA(Scintillation Proximity Assay)系統
用親合素包被的氟微球作為固相載體，用生物素標記引物，在擴增時摻入氟化的核苷酸，擴增完成后，加入已包被的氟微球以捕獲生物素化的PCR產物，此捕獲過程可使與氟微球緊密結合，氟被氘激發產生光脈沖，可用閃爍計數儀測量。與比色法相比，此法具有更大的線性范圍。
5）點雜交檢測系統將擴增產物變性后固定于尼龍膜表面，與標記的DNA探針雜交，亦可將序列特異的寡核苷酸探針通過多聚T(poly
T)尾巴固定于膜上，與變性后的已標記的擴增產物雜交，在后者由于靶基因不是直接結合于膜表面，故其反應動力學接近于液相，反應速度快，通常使用生物素化的探針或擴增產物，用親合素-AP結合物產生顏色斑點，通過與已知濃度的標準比較顏色強度進行定量。
6） 電化學發光檢測系統通過親合素-生物素系統將擴增產物結合于磁性珠，然后與2，2'-聯吡啶-釕螯合物(TBR)標記的探針雜交，加入三丙胺
(tripropylamine，TPA)溶液，并轉移至電化學發光儀的檢測池，當電極的電壓增加至一定水平時TPA和TBR都瞬時氧化，TPA氧化后生成一種不穩定的、具有高度還原性的中間物質，可與氧化的TBR反應，使之進入激發態，當由激發態變為基態時可發射出620nm的光，發光強度與TBR標記物的量成正比，通過發光強度對PCR產物定量，此法的敏感性為amol水平，可自動化測量。
7） DNA酶免疫測定系統通過抗DNA單克隆抗體與擴增產物結合、再通過酶第二抗體結合物進行定量測定。此法不需對引物和擴增產物進行標記，但易出現交叉反應和單克隆抗體昂貴的費用限制了此法的廣泛應用。
8）
激光誘導熒光檢測法首先用熒光標記物FAM(商品名)的N-羥基琥珀酰亞胺酯衍生物借助氨已基連接臂偶聯于正向引物的5'-核苷酸上，然后PCR擴增，用毛細管電泳擴增產物，最后用氬離子激光光原檢測器檢測熒光強度進行定量測定。此法的優點為樣本用量少，可自動化檢測，快速、靈敏和高分辨率。
總之，可用上述方法對靶基因定量，其準確性可通過復管測定和利用內標使數據標準化而得到提高。由于親合素介導的固相捕獲生物素標記靶分子的技術具有有效、靈活和容易操作等特點，有較好的臨床應用前景。定量PCR仍然存在技術上的問題，目前多用于研究，但在腫瘤、細菌、真菌和病毒性疾病的診斷和治療方面對此技術的需求將日益增加。
五、免疫PCR的應用和發展
免疫PCR技術目前尚處于研究階段，還沒有一個十分成熟和滿意的方法，配套試劑尚缺乏，所以應用的還不多，在報道的幾種方法中均是用一些已知的標準品進行試驗。Sano，Ruzicka和Hong
zhou分別用牛血清白蛋白、小鼠IgG和重組人原癌基因產物ETS;蛋白作為待檢抗原進行免疫PCR，他們的結果均表明免疫PCR的敏感性比ELISA
高105倍，且PCR產生的背景信號很弱，可以檢測到幾百個分子的抗原，在理論上免疫PCR可以檢測到一個分子抗原，因此，免疫PCR特別適用于檢測一些含量特別少的抗原分子。目前介紹的免疫PCR還存在一些缺點，在報道的文獻中均采用待檢抗原直接吸附固相，這樣固相的均質性必然對結果有很大的影響;同時檢測的樣品液中其它成分也可以吸咐固相，極易產生背景過高或精確度下降。另外，有些難于吸咐固相的抗原也就不能用免疫PCR檢測，連接分子的特異性和均質性對PCR影響很大，從理論上看Hong
zhou的生物素標記抗體和DNA以及用游離的鏈親和素連接抗體和DNA是一比較理想的方法，但是如能做到生物素化抗體、親和素和生物素化DNA3個分子預先連接一個復合物，那么將簡化實驗過程。PCR擴增過程相對簡單，如用微量板作為固相需選用配套的PCR儀，否則需將其移入反應管內，這必然導致很大的誤差，經放大可產生顯著差異。固相也可以直接采用某些PCR反應管，并且可以直接用一般的PCR儀進行擴增，但沖洗過程相對復雜一些。免疫PCR具有非廣泛的應用前景，十分有必要進一步完善免疫PCR的實驗過程和配套試劑的研制。