免疫PCR試驗方法全解析

*、材料與方法
【生物素標記特異性抗體的制備】
  免疫球蛋白的Fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結合的Biotin-hydrazide作生物素標記。
  ① 將純化的抗體(IgM或IgG，0.1~1.0ml)在標記緩沖液(0.1Mol/L NaAc，pH值5.5，0.1Mol/L NaCl)中4℃透析放置一個晚上。
  ② 吸取0.5ml至微量離心管中，加過碘酸鈉溶液至終濃度為10mMol/L，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
  ③ 將氧化的抗體過PBS平衡的Sephadex G25 PD-10預裝柱，使之與過碘酸鈉分開。收集蛋白峰。
  ④ 向抗體管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至終濃度5mMol/L，置混搖器上室溫孵育1h。
  ⑤ 用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25預裝柱，將生物素標記的抗體分子過柱與游離的生物素分開。收集蛋白峰，保存-20℃。    
【生物素標記DNA段的制備】
    作為將與抗體偶聯的報告DNA段，應確保在待測抗原來源的機體DNA中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告DNA去檢測人源的標本。DNA段大小為300~500bp，生物素標記可采用PCR方法，根據報告DNA的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5’端堿基上帶有生物素標記。
在0.5mlPCR管中按表將下列試劑混合。
表PCR系統組成
  
·加水至100uL 
·混勻后上面覆蓋液體石蠟。
·95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40個循環。zui后72℃延伸10min。
·加等量酚-抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL無水乙醇，置-70℃30min。
·離心沉淀DNA段，用70%乙醇洗一次。
·將沉淀DNA干燥后溶于TE緩沖液中，保存在-20℃。
【制備抗體-親和素-DNA復合物】
    將生物素標記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的生物素標記的DNA段，繼續孵育30min，zui后加入10倍分子濃度的生物素，將親和素分子上的結合部位飽和。zui后過凝膠過濾柱將復合物與未結合的單體分開，加入BSA達1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
【免疫PCR】
  ① 按常規ELISA方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃過一夜。
  ② 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封閉液(PBS含10mg/ml BSA，1mg/ml魚精DNA)，室溫孵育30min。
  ③ 用TETBS(其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3)洗三次。
  ④ 將抗體-親和素-DNA復合物稀釋于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml魚精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
  ⑤ 用TETBS洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
  ⑥ 每管中加50ulPCR反應液，含有表成分：
  
·加水至50μL 
·混勻后上面覆蓋液體石蠟。
·95℃加熱5min，然后在PCR儀上按下列程序擴增35個循環：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。zui后72℃延伸10min。
·每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結果，如在PCR時加入了放射性核素標記，則可用X光片顯影。
·亦可在凝膠電泳后做Southern-blot，用特異性探針雜交，進一步提高其特異性和敏感性。
第二、注意事項
    1.本實驗的關鍵步驟是獲得適當的抗體-DNA復合物  
    2.免疫PCR具有高敏感性。
    因此，抗體和標記DNA的任何非特異性結合均可導致嚴重的本底問題。因而在加入抗體和標記DNA后必須盡可能徹底地清洗。即使有些特異性結合的抗體或標記DNA被洗掉了，亦可在zui后通過增加PCR的循環次數得到彌補。
    3.應用有效的封閉劑對防止非特異性結合也是非常重要的。 
    4.標記DNA序列完全是人為選定。 
    5.【免疫PCR試驗方法】可以檢測到常規免疫學方法無法檢測的樣品。因此，應用免疫PCR可在微觀水平(單細胞)檢測抗原，定量PCR產物可以估計某一標本中的抗原數量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時檢測到微量的抗原。