ctDNA甲基化檢測在腫瘤診療中的價值

循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）來源于腫瘤細胞的凋亡、壞死或分泌產生的DNA片段，是循環游離DNA（circulatingcell-free DNA，cfDNA）的一部分。健康人群中大部分cfDNA的長度在70~200 bp，但腫瘤患者的ctDNA長度可能為200 bp甚至超過1000 bp。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點突變、重排、擴增、微衛星改變、表觀遺傳修飾等。當腫瘤DNA進入血液時，這些基因缺陷模式在血漿和血清中也可被檢測到。

甲基化是DNA的一種重要修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基轉移到特定堿基上的過程。哺乳動物中DNA甲基化主要發生在CpG雙核苷酸的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。人基因組中60%~90%的（CpG）都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，主要位于基因的啟動子和外顯子區域，長度為300~3 000 bp。靠近或位于啟動子區域的異常甲基化一般會抑制轉錄，沉默相關基因的表達。在腫瘤中，抑癌基因和DNA修復基因啟動子區域的異常高甲基化使得抑癌基因沉默和修復基因失活，從而喪失對腫瘤發生的抑制作用，也是目前腫瘤甲基化研究的主要方向。與其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作為最早發現的表觀修飾途徑之一，其異常甲基化模式在不同腫瘤組織中具有高度特異性。特征性的甲基化"指紋"圖譜可用于癌癥早期診斷與分期、療效評估、復發監測和預后判斷等。

ctDNA甲基化檢測在癌癥診療應用中，基于血液標本一定程度上可以克服實體瘤組織標本的局限性，例如：（1）ctDNA在血液中半衰期短，可以實時反映腫瘤的動態變化；（2）可以克服腫瘤組織取樣的異質性；（3）重復活檢可以追蹤腫瘤的克隆演變；（4）可以識別轉移性腫瘤。因此，在過去的30年中，DNA甲基化被認為是有希望檢測癌癥的生物標志物[1]。

一、ctDNA甲基化檢測技術方法及研究思路

1．常用檢測方法及技術難點：

目前，ctDNA甲基化標志物的研究思路已經比較明確。首先，通過芯片或二代測序對腫瘤組織和正常組織進行全基因組范圍的甲基化信號掃描，尋找腫瘤特異的甲基化標志物位點；然后再針對這些位點對ctDNA進行性價比更高的靶向測序，驗證標志物性能。雖然研究思路比較清晰，但甲基化檢測技術的諸多局限也一直困擾著研究人員。一方面，血液ctDNA含量很低，某些特定類型的腫瘤或中晚期腫瘤有可能達到20 ng/ml。技術上最大的挑戰是需要從含有不同數量cfDNA的血液樣品中鑒定極少量的ctDNA。另一方面，目前甲基化檢測技術基本上均基于亞硫酸氫鹽（bisulfite，BS）使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶（C）脫氨基轉變成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不變。目前基于BS的甲基化檢測技術主要包括PCR擴增、測序以及基于雜交的捕獲技術[2]，其中擴增的應用較廣泛。BS處理后未甲基化的C變U，PCR擴增后U配對T，因此擴增后DNA變為富含A和T（AT-rich），與原本具有甲基化修飾的C堿基區分開來。但是，研究發現擴增過程中甲基化狀態的DNA（GC含量高）易產生擴增偏好，在文庫中富集。所以，需要在高效捕獲BS DNA片段的同時，還要保證甲基化信號在擴增過程中均勻放大，不走樣。

2．近年來研究思路的突破方向：

過去研究多聚焦于單基因啟動子區甲基化，研究發現多基因組合檢測可以進一步提高DNA甲基化特征的特異性和敏感性。隨著生物信息技術的快速發展，甲基化檢測逐漸由單基因向多基因組合以及全基因組水平拓展。2017年Nature Genetics雜志發表的一篇文章定義了147 888塊緊密耦合的CpG位點，稱為甲基化單倍體塊（CpG methylation haplotypes block，MHB）。經過對61個全基因組BS測序數據集進行分析，并使用101個BS測序數據集和637個甲基化芯片數據集進行驗證，證實大小為95 bp并含有≥3個CpG位點的MHB在大約170 bp的cfDNA中更容易被檢測到。最后使用MHB對59例肺癌或結直腸癌患者的腫瘤組織和循環cfDNA進行了評估，發現借助腫瘤特異的MHB模式可以進一步提升甲基化指紋的準確性，從痕量檢測中發現甲基化的組織來源[3]。2017年，通過機器學習對全基因甲基化譜進行分析后，發現了4種常見腫瘤的特異性甲基化分子標志物，包括肺癌19個、結直腸癌6個、乳腺癌15個、肝癌3個。這些標志物能夠從正常組織中區分出腫瘤，準確率大于95%。進一步對結直腸癌30例肝轉移灶和34例肺轉移灶進行無監督分層聚類分析，發現高度組織特異性的甲基化特征可以正確診斷腫瘤起源，診斷正確率分別高達96.7%和94.1%[4]。與上述研究方法類似，研究人員在大樣本肝癌研究中篩選出10個甲基化標志物，建立起血液肝癌的ctDNA甲基化診斷模型。經證實該模型可以區分正常人群、肝病背景（肝炎，肝硬化等）和肝癌患者，并與肝癌的腫瘤負荷、治療反應和臨床分期關聯良好，再次證實了ctDNA甲基化檢測的臨床優勢[5]。

二、ctDNA甲基化檢測的臨床應用

1．ctDNA反映基因啟動子區高甲基化的一致特征，可以用于腫瘤診斷：

與DNA突變相比，基因特定啟動子區域的異常甲基化可能是癌癥的一致特征，例如，90%的前列腺癌中谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）基因被甲基化[6]，96%的乳腺癌中分層蛋白（stratifin，SFN）基因被甲基化[7]，同源框蛋白A9（homeoboxA9，HOXA9）基因和鋸齒狀同源框蛋白1（engrailed homeobox 1，EN1）基因分別在95%和80%的卵巢腫瘤中被甲基化[8]，73%的肝細胞癌中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因被甲基化[9]。高度一致的甲基化特征使得ctDNA甲基化廣泛地適用于腫瘤診斷。用于診斷的商業產品也已經面市，如基于糞便的結直腸癌篩查試驗將N-myc下游調節基因4（N-mycdownstream regulated gene 4，NDRG4）與骨形態發生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因的甲基化改變與突變檢測相結合，在2014年獲得了美國FDA批準，是第一個基于DNA甲基化檢測的診斷試驗[10]。此外，Epi proColon檢測分析Septin 9基因的甲基化用于全結直腸癌篩查[11]，以及Epi proLung檢測分析矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox 2，SHOX2）基因甲基化用于肺癌篩查由中國FDA于2015年7月批準[12]。

2．ctDNA甲基化檢測反映腫瘤負荷變化，可用于監測治療反應：

癌癥特異性ctDNA甲基化模式可用于定量腫瘤DNA，提供有關腫瘤負荷水平的信息。研究表明周期素依賴性激酶抑制因子2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因中位甲基化指數（甲基化的循環CDKN2A/總循環CDKN2A）由術前35%下降為術后3.5%[13]。在44%~68%的食管癌患者的腫瘤中檢測到APC基因的甲基化[14]，食管癌患者術后血液中腺瘤性結腸息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因甲基化水平與術后腫瘤殘余顯著相關[15]。

除了反映手術后腫瘤負荷的下降，ctDNA甲基化還可以反映腫瘤對化療藥物的反應。目前，大多數轉移性惡性腫瘤需要至少3個周期的化療，然后才能根據常規成像和生物標志物來評估治療反應。這種延遲使許多患者暴露于不必要的藥物毒性下，并延誤其他潛在有效的治療時機。早期檢測對治療藥物的反應對于改善腫瘤患者結局是必不可少的，目前常規監測主要通過檢測血液蛋白質生物標志物來進行。ctDNA甲基化檢測反映腫瘤負荷變化的特征使其有望成為監測治療反應的新方法。一些研究報道了在化療期間多個時間點使用ctDNA甲基化定量來監測腫瘤動態，例如使用血漿中ctDNA甲基化GSTP1來追蹤前列腺癌患者對化療的反應。在35例接受多西他賽或米托蒽醌治療的探索性患者隊列中，首次化療后2~38個月（中位數15個月）內血漿甲基化GSTP1水平升高，隨后前列腺特異性抗原（prostate specificantigen，PSA）水平升高，表明血漿甲基化GSTP1可能是較PSA更好的總生存率預測指標[16]。Fackler等[17]通過全基因組甲基化芯片篩選和TCGA數據縮小范圍，最終選擇了10個基因的甲基化標志物用以區別乳腺癌和健康對照，然后通過追蹤使用多西他賽和伊馬替尼或卡培他濱治療的29例乳腺癌患者血清中上述標志物的甲基化水平，發現治療1~2周后上述組合甲基化水平降低，患者疾病穩定或部分緩解，無疾病進展。持續追蹤觀察到在臨床疾病進展之前可以檢測到ctDNA甲基化水平升高。此外，血清Ras相關區域家族1A（rasassociation domain family 1A，RASSF1A）和維甲酸受體β2（retinoicacid receptor beta 2，RARB2）基因甲基化水平還被發現能指示肺癌治療反應[18]。

盡管上述研究將ctDNA甲基化降低與腫瘤體積減小相關聯，從而評估化療敏感性，但考慮到血液中ctDNA的半衰期只有2 h，可以提供非常快速的針對腫瘤狀態變化的測量，2015年Wang等[19]采取了不同的思路，使用甲基化ctDNA的增加來評估化療誘導的腫瘤細胞死亡的程度。結果顯示24 h內循環甲基化RASSF1A或APC1的增加與完全/部分化療響應相關，而治療后兩個標志物沒有變化與腫瘤穩定/進展相關。這些ctDNA甲基化變化的不同方向可以通過化療誘導細胞死亡導致ctDNA的初始水平激增來解釋。與升高時間相比，化療后ctDNA甲基化下降時間的范圍從1周到1年不等，這些波動強調了對化療作出反應時詳細表征ctDNA動力學的重要性。

3．ctDNA甲基化檢測可反映腫瘤的預后、侵襲和復發：

甲基化可以通過沉默調節細胞生長和轉移潛能的基因來促進腫瘤進展，還可以反映腫瘤亞型，所以其又與腫瘤預后相關聯，許多研究用以指示腫瘤侵襲和復發的可能性。ctDNA甲基化與腫瘤預后的研究中，所選基因在癌癥相關過程中功能已知，如細胞增殖，凋亡等，例如胃癌中X連鎖凋亡抑制蛋白相關因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor 1，XAF1）基因的甲基化與生存率下降有關，手術后甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者的中位無病生存期分別為23.4個月和39.6個月[20]。性別決定區Y基因盒17（sexdetermining region Ygene box 17，SOX17）基因通過調節WNT信號傳導途徑發揮抑瘤作用，其表達抑制能夠促進腫瘤發生。兩組研究報道了血液中SOX17甲基化與食管癌和胃癌的預后不良有關。在40例食管癌患者隊列中，使用包括SOX17等在內的8個基因的啟動子和外顯子1區的9個CpG甲基化探針用于預測預后，發現SOX17是多變量分析中的獨立預后因素[21]。在另一組73例胃癌患者隊列中，血清SOX17甲基化與腫瘤分化以及總生存期相關[22]。RARB2是一種視黃酸受體，通常發揮抑瘤作用，其甲基化一直被證明與結直腸癌、乳腺癌和肺癌預后不良相關[18]。在胃癌中，RUNT相關轉錄因子（runt related transcription factor 3，RUNX3）基因術前血清甲基化水平在晚期階段高于早期階段，且復發病例術前血清RUNX3甲基化明顯高于非復發病例，很可能是由于ctDNA甲基化水平反映了腫瘤負荷。此外，評估血清RUNX3甲基化和CEA可改善對結直腸癌的診斷[23]。

綜上，ctDNA甲基化能克服現有腫瘤標志物特異性差，假陽性率高的缺點，在臨床應用方面展現出廣闊前景。但是，我們也應該意識到ctDNA甲基化檢測距離真正進入臨床實踐還有很長的路要走。主要應注意以下幾點：（1）因為臨床試驗中抗腫瘤的療效評價需要長期隨訪收集完整的治療信息和預后信息，目前在臨床上存在較大困難。ctDNA甲基化檢測應注意樣本收集的時間點，如治療前后對比來評估療效，甚至治療全程多時間點依次收集樣本來監測病程。（2）ctDNA在血液中半衰期較短，其甲基化動力學變化應納入考慮。（3）技術進步使得檢測數萬個CpG位點成為可能，但是全基因組ctDNA甲基化檢測技術對生物信息學提出了更高的要求。（4）ctDNA甲基化標志物的診斷效能仍需與其他癌癥循環生物標志物進行比較。未來ctDNA甲基化檢測可用于癌癥個體化實時診治，包括癌癥篩查、診斷、療效監測及預后判斷。