PCR技術（二）：PCR反應模板的制備
PCR反應的關鍵因素主要有引物的選擇與設計，酶的質量.模板的制備，在前二者都穩定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要.模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質和量及PCR的成敗.而提高模板核酸質量的 關鍵是除去雜質(蛋白質、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的產量. 傳統的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細胞組份，溶解細胞膜， 使蛋白質變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質，尤其是與DNA結合的蛋白質，再用 酚:氯仿抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用.但近幾年來也發展了些 簡便實用較為有效的標本消化處理方法.亦可滿足PCR實驗的要求.采用哪種方法消化 處理標本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環境條件而定.模板核酸的提取制備方法 (一)蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳.如組 織細胞(包括石......閱讀全文
PCR技術（二）：PCR反應模板的制備
PCR反應的關鍵因素主要有引物的選擇與設計，酶的質量.模板的制備，在前二者都穩定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要.模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質和量及PCR的成敗.而提高模板核酸質量的 關鍵是除去雜質(蛋白質、酶、脂肪等).除去抑制Taq DN
PCR的模板制備
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。 模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。 標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難
用于－PCR－的模板－DNA－制備實驗
酚-氯仿法提取石蠟組織中 DNA 改進的石蠟切片 DNA 提取方法 直接法（DNA 免提法） 冰凍片 含血標本 胸腹水或尿液 ? ? ? ? ? ?
用于－PCR－的模板－DNA－制備實驗
實驗方法原理 實驗步驟 1. 10 mm 厚石蠟切片 10～15 張，置入消毒后的 1.5 ml Eppendorf 管中。2. 脫蠟 二甲苯 1200 μl，9000 r/min，8 min×3。3. 脫水無水乙醇 1200 μl，9000 r/min，5 min×3。4. 打開 Eppendor
聚合酶鏈式反應（PCR）模板的制備
模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。標本處理的基本要求是除去雜質，并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以
用于－PCR－的模板－DNA－制備實驗——冰凍片
實驗步驟1. 將 10 μl 冰凍切片直接放入含組織裂解液的離心管中。2. 無菌尖頭刀片刮下，放入 300～900 μl 組織裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55℃ 3 h 以上。3. 其間用指輕彈離心管以利裂解。若有沉淀，再加入 5～10 μ
用于－PCR－的模板－DNA－制備實驗——含血標本
實驗步驟1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的無菌離心管（15 ml 管）中。2. 2000 r/min 離心 10 min。吸去血漿，用指彈勻剩余的有核細胞和紅細胞，加入紅細胞溶解液 10 ml 并混勻，常溫下放置 30 min。紅細胞溶解液配
高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法（二）
1.2? 植物材料 ?1.2.1 水稻秧苗。將1.6-mL 96方孔板底部用6 mm電鉆頭打穿，或將舊96孔PCR板的底部剪去約4 mm。使用時將方孔板壓入少量泥巴。每孔放入1粒萌動的水稻種子，在自然日光下(或人工氣候箱)生長至3~4片葉。其他植物小苗也可用類似方法種植。?1.2.2 水稻大植株的鮮
PCR技術要素模板(靶基因)核酸
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是: 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別
用于－PCR－的模板－DNA－制備實驗——胸腹水或尿液
實驗步驟1. 標本 10 ml 以上，2000 r/min 離心 10 分鐘，倒去上清液。用指彈勻沉淀物，加入適量組織裂解液，37℃ 下放置半小時以上。2. 無菌尖頭刀片刮下，放入 300～900 μl 組織裂解液中，并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K（PK）10～15 μl，封口膜封口，置 55
PCR的模板最大是多少
長片段PCR擴增試劑盒所用的酶是Taq聚合酶和有校正功能的聚合酶的混合酶,這種混合酶可以染色體和其它細胞器的DNA為模板高效進行PCR反應。在人的染色體上可以擴增出27kb的DNA片段,而以DNA為模板則可以擴增出40 kb的片段.現在的那些試劑盒還是比較牛的
用于PCR的模板DNA制備實驗——直接法（DNA－免提法）
實驗步驟1. 標本太少時，可將一張石蠟切片經脫蠟，水化，蒸餾水清洗，無菌蒸餾水浸泡，取出晾至半干。2. 加入 20～80 μl 直接裂解液中，加 20 mg/ml 蛋白酶 K 0.2～1 μl，放置 55℃ 裂解 3 h 以上；100℃10 min 滅活蛋白酶 K；10000 r/min 離心 10
PCR實驗技術指南之PCR反應參數
1. 變性：在*輪循環前，在94℃下變性5-10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR 失敗，因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快復性
PCR實驗技術指南之PCR反應參數
1. 變性：在*輪循環前，在94℃下變性5-10min 非常重要，它可使模板DNA 完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR 失敗，因為未變性完全的DNA 雙鏈會很快復性
PCR技術反應的控制
①PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子②鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L ③底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L ④TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul） ⑤引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L ⑥反應溫度和循
PCR反應技術的特點
1、特異性強決定 PCR 反應特異性的因素有:①引物與模板 DNA 特異分子的正確結合;②堿基配對原則;③ Taq DNA 聚合酶合成反應的忠實性;④靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵,它取決于所設計引物的特異性及退火溫度。在引物確定的條件下,PCR 退火溫度越高,擴增的特異性越
PCR實驗技術（二）
【方法】方法一、基本的PCR方法下面介紹的基本PCR方法可作為任何PCR擴增的一般指導和出發點。由于各種PCR反應條件（如PCR擴增次數、溫度、Taq?DNA聚合酶的濃度、引物、氯化鎂以及模板DNA）變異極大，應根據具體情況，對各種PCR反應條件進行相應調整。1．按以下次序，將各成分加入0.2?ml
直接PCR技術，讓PCR更簡單（二）
直接PCR（Direct PCR）是一種不經核酸提取而直接使用動物或植物組織等直接進行擴增的反應。在許多方面，直接PCR的工作方式類似于常規PCR。主要區別是直接PCR中使用的定制緩沖液，樣本可不經過核酸抽提，直接進行PCR反應，但對于參與直接PCR反應的酶的耐受性和buffer的兼容性有相對應的要
高GC比模板的PCR擴增
PCR條件的優化是一個麻煩耗時的過程，涉及到溫度、時間、鎂離子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多個因素的調整。一般來說利用熱啟動，比如Platinum Taq?DNA聚合酶（Invitrogen）可以達到更高的特異性，降低對鎂離子濃度的依賴，并且有利于提高“問題模板”的產量。然而，傳統的PCR條件
高GC比模板的PCR擴增
PCR條件的優化是一個麻煩耗時的過程，涉及到溫度、時間、鎂離子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多個因素的調整。一般來說利用熱啟動，比如Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）可以達到更高的特異性，降低對鎂離子濃度的依賴，并且有利于提高“問題模板”的產量。然而，傳統的PCR條件
高GC比模板的PCR擴增
PCR條件的優化是一個麻煩耗時的過程，涉及到溫度、時間、鎂離子、引物、dNTP、Taq酶、模板等多個因素的調整。一般來說利用熱啟動，比如Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）可以達到更高的特異性，降低對鎂離子濃度的依賴，并且有利于提高“問題模板”的產量。然而，傳統的PCR條件
PCR反應技術的反應基本步驟
PCR 全過程包括三個基本步驟,即雙鏈 DNA 模板加熱變性成單鏈(變性);在低溫下引物與單鏈DNA互補配對(退火);在適宜溫度下 Taq DNA 聚合酶以單鏈 DNA 為模板,利用4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)催化引物引導的 DNA 合成(延伸)。這三個基本步驟構成的循環重復進行,可使特異性 DN
PCR基因芯片上熒光PCR反應的研究（二）
1.3.2 ?PCR-SSCP方法分析按照我室常規進行。 1.3.3 ?Taqman熒光探針 以發現的ALAS2基因第五外顯子點突變為中心設計，序列如下： 5’ （熒光集團）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC- TAMRA（淬滅集團） 3’，設計Taqman熒光PCR反應的上下
高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法（四）
2.3 ?高通量的分子標記檢測?本方法制備的DNA濃度雖然低，用96針復制器加入0.5~1 μL模板進行33~35個PCR循環就可獲得足夠濃度的產物，并不需要加入特別多的Taq酶(甚至使用量為每45~50 μL PCR反應液1 U也能擴增分子標記)。該方法已對數萬份水稻樣品進行了分子標記(S
高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法（三）
將純化定量的水稻品種(93-11)基因組DNA標準樣品(0.5~8 ng)與1.0 μL本方法制備的水稻品種(02428)基因組DNA混合作為模板，用InDel 標記引物(表1)進行PCR擴增和PAGE檢測。箭頭指某反應(或2個反應之間)其02428與93-11條帶的信號值大致相等(即DNA
高通量的PCR模板植物基因組DNA制備方法（一）
摘? 要：制備大量生物樣品的模板DNA用于PCR檢測是費時費人工的工作。本文介紹一種高通量的植物基因組DNA(gDNA)快速制備及其用于PCR基因型檢測的操作方法。將一小段單子葉植物苗葉片(長度約30 mm或40 mm，與96方孔板的孔深大致相同) 或一小塊(約2~4 mg)雙子葉植物葉片放入9
PCR技術基本反應步驟
ＰＣＲ是Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（聚合酶鏈式反應）的首字母縮寫，簡單說來，ＰＣＲ是由高溫變性—低溫退火—中溫延伸三個基本反應步驟構成：０１ ＤＮＡ的變性成為單鏈模板ＤＮＡ經加熱至９５℃左右一定時間后，使模板ＤＮＡ雙鏈解離成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；０２低溫
PCR反應體系和條件(二)
PCR反應條件的選擇 PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。? 溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA
PCR技術反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。?溫度與時間的設置: 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模
PCR技術的反應特點介紹
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為： ①引物與模板DNA特異正確的結合； ②堿基配對原則； ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性； ④靶基因的特異性與保守性。 其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDN