編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
用鹽酸胍進行干燥膜的變性/復性循環試劑、試劑盒HEPES結合緩沖液實驗步驟1) 按基本方案步驟1?15進行。2) 將平皿在4℃冷卻10 min。用針扎孔標記各膜的位置。小心地揭起膜，室溫下在空氣中瞭干15 min。3) 將膜浸于HEPES結合緩沖液/6 mol/L鹽酸狐中，4℃輕輕搖動溫育10 min。在新 鮮的HEPES結合緩沖液/6 mol/L鹽酸胍中重復1次。4) 將膜浸于HEPES結合緩沖液/3 mol/L鹽酸胍（每10張膜50 mL)中，4℃ 5 min。 重復4次。每次用HEPES緩沖液及濃度較前次減半的鹽酸胍進行漂洗。5) 將膜浸于HEPES緩沖液（50 mL/10張膜）中，4℃ 5 min。用新鮮緩沖液重復洗1次。6) 在BLOTTO中溫育封閉。7) 進行濾膜篩選。展開......閱讀全文
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
用鹽酸胍進行干燥膜的變性/復性循環試劑、試劑盒HEPES結合緩沖液實驗步驟1) 按基本方案步驟1?15進行。2) 將平皿在4℃冷卻10 min。用針扎孔標記各膜的位置。小心地揭起膜，室溫下在空氣中瞭干15 min。3) 將膜浸于HEPES結合緩沖液/6 mol/L鹽酸狐中，4℃輕輕搖動溫育10 mi
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA結合蛋白的活性實驗材料大腸桿菌 Y1089試劑、試劑盒含有或不含10 mmol L MgCl2的LB培養液1010pfu mLλgtU重組噬菌體液1 mol L IPTG抽提緩沖液5 mg mL溶于抽提緩沖液中的溶菌酶（保存于-20℃)儀器、耗材4 mol L Na
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
實驗方法原理 實驗材料 含有多個串聯拷貝識別位點的、缺乏識別位點的（或含識別位點突變的）pUC重組質粒DNA試劑、試劑盒 限制性內切核酸酶EcoRI及HhdIII1 mol L Tris ? Cl pH 7. 55 mmol L dCTPdGTPdTTPdATP5000 Ci mmol [α32P]
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗
用位點識別DNA篩選λgtll表達文庫 用鹽酸胍進行干燥膜的變性/復性循環 從重組溶源菌中制備粗提物鑒定DNA結合蛋白的活性 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理
編碼DNA結合蛋白的cDNA克隆的檢測、純化和鑒定實驗1
一個DNA位點識別探針被用來從表達文庫中檢測合適的重組克隆，并對 之進行純化，證明其中編碼了具有一定序列特異性的DNA結合域。這種策略排除了為 分離其基因而對序列特異性DNA結合蛋白進行純化的過程；只需要一個合適的構建于 λgtll載體中的cDNA文庫和一個DNA識別位點的探針。用位點識別DNA篩選
用原位篩選法分離編碼序列特異性DNA結合蛋白的cDNA
放射性標記DNA探針的制備l??????聚丙烯酰胺凝膠的制備1．按照（三）中操作流程灌制非變性聚丙烯酰胺凝膠。將10×TBE稀釋成0.5×的工作濃度。聚丙烯酰胺的工作濃度取決于待測DNA片段的大小，200bp左右的片段需要4～5％的凝膠，小于100bp的片段應灌制6～8％的凝膠。?l??????DN
質粒DNA的分離、純化和鑒定
材料、設備及試劑 一、材料 含質粒的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。 二、設備 微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床， 高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)， 渦旋振蕩器， 電泳儀，瓊脂糖平板
序列特異性DNA結合蛋白的親和層析純化實驗
DNA親和介質的制備 DNA偶聯于溴化氰活化的瓊脂糖上 用制備性凝膠電泳純化寡核苷酸 DNA親和層析法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理
序列特異性DNA結合蛋白的親和層析純化實驗
實驗方法原理 實驗材料 兩種帶有結合位點的合成寡核苷酸各440μg試劑、試劑盒 TE緩沖液 pH 7.810×T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液20 mmol L ATP (鈉鹽） pH 7.0150 m Ci mL [γ-32P] ATP (6000 Ci mmol)10 U μL T4噬菌體多
質粒DNA的分離、純化和鑒定－（三）
操作步驟? 一、 細菌的培養和收集? 將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基（含50μg/ml Amp）中, 37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養基（含50μg/ml Amp）中,37℃振蕩培養約12小時至對數生長后期。? 二、 質粒DNA
DNA結合蛋白測定實驗
本實驗主要用于檢測粗制提取物中序列特異性的DNA結合蛋白。實驗方法原理本分析方法是一種簡單、快速和極為靈敏的用于檢測粗制提取物中序列特異性的DNA結合蛋白的方法。在電泳時，與末端標記的DNA片段特異結合的蛋白質阻滯了片段的遷移，因而產生對應于蛋白-DNA復合物的清晰電泳條帶。實驗材料質粒DNA試劑、
DNA結合蛋白測定實驗
實驗材料 質粒DNA試劑、試劑盒 dNTPDNA聚合酶Klenow酶TETAE溴化乙錠TEMED過硫酸銨BSA儀器、耗材 培養箱離心管實驗步驟 1. ?用一種或多種限制性內切酶在100 μl 體積中消化10 μg 質粒人，產生25~100 bp ?的含有結合位點的DNA片段，并至少有一端是5’突出的
DNA結合蛋白測定實驗
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 本分析方法是一種簡單、快速和極為靈敏的用于檢測粗制提取物中序列特異性的DNA結合蛋白的方法。在電泳時，與末端標記的DNA片段特異結合的蛋白質阻滯了片段的遷移，因而產生對應于蛋白-DNA復合物的清晰電泳條帶。
轉化克隆的篩選和鑒定實驗
實驗原理利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質粒上帶有外源基因插入片段的克隆菌落。實驗試劑1. LB培養基(加抗菌素)2. PCR用試劑3. 引物4. 質粒提取用試劑5. 酶切需要的限制性內切酶及其緩沖液，70%甘油(70%甘油，0.1mol/L Mg
真核表達文庫的構建與篩選實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 宿主細胞 質粒或λ噬菌體表達載體 包裝提取物 電轉化感受態大腸桿菌 試劑、試劑盒
真核表達文庫的構建與篩選實驗
實驗材料 宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體包裝提取物電轉化感受態大腸桿菌試劑、試劑盒 限制性內切核酸酶緩沖液限制性內切核酸酶通過 poly(A)+富集的 mRNAcDNA 文庫含適當抗生素的 Terrific 球脂平板含適當抗生素的 Terrific 肉湯培養基儀器、耗材 cDNA 合成試劑盒實驗步驟
真核表達文庫的構建與篩選實驗
類似方案 1、方案 2 描述了在真核表達載體上進行 cDNA 文庫構建與篩選的方法, 流程分為以下兩個階段：1. 在真核表達載體上構建 cDNA 文庫；2. 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體
粘粒和質粒克隆的純化實驗
實驗材料 質粒試劑、試劑盒 LB抗生素儀器、耗材 涂布棒硝酸纖維濾膜實驗步驟 1. ?通過原位雜交檢測硝酸纖維索濾膜上影印菌落。2. ?用無菌的牙簽挑出陽性克隆，接種到含適當抗生素的1 ml 冷的LB培養基中，保存在4℃抑制細菌生長。3. ?取1~25 μl 菌懸液涂布在含有相同抗生素的平板上，37
粘粒和質粒克隆的純化實驗
文庫一旦包裝就應該盡快進行擴增，它可以大大增加文庫的拷貝數，但在擴增時由于克隆的生長速率不同，文庫的組成可能會出現某種潛在的改變。這種文庫克隆組成比率的變化可以通過把文庫克隆預吸附到細菌上并使用一種高密度鋪平板和短期培養的方法而盡量減少。實驗材料質粒試劑、試劑盒LB抗生素儀器、耗材涂布棒硝酸纖維濾膜
粘粒和質粒克隆的純化實驗
基本方案 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 質粒 試劑、試劑盒
序列特異性DNA結合蛋白親和層析純化實驗DNA親和介質制備
實驗材料兩種帶有結合位點的合成寡核苷酸各440μg試劑、試劑盒TE緩沖液 pH 7.810×T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液20 mmol L ATP (鈉鹽） pH 7.0150 m Ci mL [γ-32P] ATP (6000 Ci mmol)10 U μL T4噬菌體多核苷酸激酶（New Eng
DNA－結合蛋白的凝膠阻滯分析實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 作為對照的核提取物或蛋白組分 核提取物或蛋白組分 試劑、試劑盒 Ficoll 400 聚
DNA－結合蛋白的凝膠阻滯分析實驗
實驗材料 作為對照的核提取物或蛋白組分核提取物或蛋白組分試劑、試劑盒 Ficoll 400聚乙烯醇蔗糖染色液10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)緩沖液4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝膠poly(dI-dC)32P標記的對照DNA32P標記的靶DNA儀器、耗材 雜交膜實驗步驟 材
DNA－結合蛋白的凝膠阻滯分析實驗
凝膠阻滯試驗分析 DNA 結合蛋白的方法是 Fried 和 Crothers(1981) 發明的，它是第一次為大腸桿菌乳糖阻抑物與其 DNA 結合位點的相互作用提供了動態的分析方法。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。實驗材料作為對照的核提取物
實驗九－轉化克隆的篩選和鑒定
1．目的學會用酶切法或PCR法篩選重組質粒轉化成功的克隆菌。2．原理利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質粒上帶有外源基因插入片段的克隆菌落。3．器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴
如何進行質粒DNA的分離，純化和鑒定
分離質粒時，可以將質粒去得很干凈。方法為：先用TE之類的試劑將菌液懸浮起來，再用NaOH和SDS將菌液裂解（起裂解作用的主要是NaOH，但此時，SDS可以與蛋白很好的結合）。第三步，加入酸中合第二步中的堿，并且將SDS沉淀下來，同時，SDS和蛋白也一起沉淀下來，而基因組上面有很多的蛋白，這樣基因組就
單克隆抗體的純化實驗——單克隆抗體的純化實驗
1~5 ml/min?的速度上樣于蛋白A-Sepharose柱，用Tris緩沖液洗柱子直至所有的未結合的蛋白都被洗脫，采用A280監測。?3. ?依次用2~3倍柱床體積的檸檬酸緩沖液、乙酸緩沖液液以及甘氨酸·Cl緩沖液連續洗脫結合蛋白，洗脫下的蛋白直接接入裝有中和緩沖液的管中，中和緩沖液的體積應為所
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
試劑、試劑盒 擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液T4DNA 連接酶熱穩定 DNA 聚合酶瓊脂糖凝膠BACDNA缺口平移緩沖液雜交液平末端 cDNACot1 基因組 DNA胞漿 poly(A)+RNAdNTP 溶液DNA 分子質量標志物寡
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 擴增緩沖液 DNA 聚合酶 DNaseI 限制性內切核酸酶 ATP 鏈霉親和素-磁珠結合緩沖液 T4DNA 連接酶
用大片段基因組－DNA－克隆直接篩選－cDNA實驗
本方案使用克隆在 BAC 載體上的一段 500kb 的人基因組 DNA 連續序列，直接篩選與其互補的的 cDNA。但本方法也可適用于任意大小的基因組靶 DNA。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。試劑、試劑盒擴增緩沖液DNA 聚合酶 DNaseI限制性內切核酸酶ATP鏈霉親和素