序列特異性DNA結合蛋白的親和層析純化實驗

兩種帶有結合位點的合成寡核苷酸各440μg

TE緩沖液 pH 7.8 10×T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液 20 mmol L ATP (鈉鹽） pH 7.0 150 m Ci mL [γ-32P] ATP (6000 Ci mmol) 10 U μL T4噬菌體多核苷酸激酶（New England Biolabs)

15 mL螺口蓋聚丙稀試管 15℃ 37℃ 65℃及88℃加熱器或水浴 60 mL粗燒結玻璃漏斗旋轉輪

1) 在1個1.5 mL的微量離心管中準備下面物質的混合物：含有每種寡核苷酸440μg的TE緩沖液，總體積為130μL。再加入20μL 10×T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液。88℃溫育2 min, 65℃10 min, 37℃10 min,室溫 5 min。

2) 將上述混合物平均分入2個微量離心管中。每管（75μL)加15μL 20 mmol/L ATP (pH 7.0)、約 5μ Ci [γ-32P] ATP, 10μL 10 U/μL T4 噬菌體多核苷酸激酶（共 100 U)。37℃溫育 2 h。

加標記的ATP時，不要化凍，僅需用移液器的黃色吸頭觸碰一下（不要刺入）凍結的[32P] ATP的上層，取少許轉入反應管中。

3) 每管中加50μL 10 mol/L乙酸銨及100μL水，65℃加熱15 min,滅活激酶，冷卻至室溫。

4) 加入750μL 100%乙醇，上下顛倒混合。室溫下高速離心15 min沉淀DNA，棄去上清。

5) 各DNA沉淀重懸于225μLTE緩沖液中。

6) 加250μL酚/氯仿/異丙醇于各管中。在渦旋混合器上振蕩1min。高速離心5 min分離兩液相，將水相（上層）移至一新管中。

7) 加250μL氯仿/異戊醇至水相中。在渦旋混合器上振蕩1 min,高速離心5 min 分離兩液相，將水相（上層）移至一個新管中。

8) 加25μL 3 mol/L乙酸鈉至水相中，振蕩混勻。然后加入750μL 100%乙醇，上下顛倒混勻，高速離心15 min沉淀DNA，棄去上清。

9) 用800μL75%乙醇洗滌沉淀，在渦旋混合器上振蕩混勻，高速離心5 min,棄去上清。

10) 在真空旋轉蒸發器（如Speedvac)中干燥DNA沉淀。

11) 加65μL水及10μL 10×接頭/激酶緩沖液至每管沉淀中，在渦旋混合器上振蕩使 DNA 溶解。加20μL 20 mmol/L ATP (pH 7.0)及 5μL 6000 U/mL T4 噬菌體DNA連接酶（30 Weiss單位）。在室溫下溫育>2 h,或者15℃過夜。

取決于所用的寡核苷酸，連接的最佳溫度可在4?30℃之間變化。

12) 用瓊脂糖凝膠電泳監測連接反應，每道加0.5μL連接反應液，并同時帶分子質量標記物。用溴化乙錠染色并在紫外燈下觀察DNA。

如果未發生連接反應，用25: 24 : 1酚/氯仿/異戊醇抽提DNA 1次，用24 : 1氯仿/異戊醇抽提 1次，然后用乙酸鈉加乙醇沉淀DNA。重新將DNA溶于225μL TE溶液中，加25μL 3mol/L的 乙酸鈉溶液，再加750μL無水乙醇重新沉淀。用75%乙醇洗滌，在Speedvac中干燥，然后重新進行連接反應。

13) 加100μL緩沖液平衡酚至1OOμL連接反應液中。在渦旋混合器上振蕩1 min,室溫下高速離心5 min,將水相（上層）移至一新管中。

14) 加100μL氯仿/異戊醇至水相中。在渦旋混合器上振蕩1 min，室溫高速離心5 min,將水相（上層）移至一新管中。

15) 加33μL10 mol/L乙酸銨至水相中，在渦旋混合器上振蕩混勻。

16) 加133μL異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃放置20 min。高速離心15 min沉淀 DNA，棄去上清。

乙酸銨/異丙醇沉淀可除去殘余的ATP，不然后者將影響連接的DNA與溴化氰活化瓊脂糖的偶聯。

17) 225μLTE緩沖液，在渦旋混合器上振蕩使沉淀溶解，加25μL 3 mol/L乙酸鈉，在渦旋混合器上振蕩混勻。加750μL 100%乙醇，上下顛倒混勻，高速離心15 min 沉淀DNA，棄去上清。

18) 用75%乙醇洗滌DNA 2次，在真空蒸發器（如Speedvac)中抽干DNA沉淀。

19) 將DNA溶解于50μL水中，-20℃保存。

不要將DNA溶于TE緩沖液中，因為TE中的Tris緩沖鹽將影響偶聯反應。

注意：在進行以下步驟之前，最好是準備好激活和偶聯反應所需的所有儀器和試劑，不要讓介質變干。

20) 將10?15 mL (穩定后的柱床體積）Sepharose CL-2B置于一個60 mL粗燒結玻璃漏斗中，用500 mL水充分洗滌。

21) 將濕的Sepharose介質移至一個25 mL量筒中，大約有10 mL介質，加水至終體積 20 mL。將所得的混懸液移至一個150 mL的玻璃燒杯中，內有磁力攪棒。將燒杯置于水浴中平衡至15℃,在通風櫥內放在磁力攪拌器上，以中慢速攪拌。

22) 在通風櫥內，稱量1.1 g溴化氰裝入一個25 mL的三角錐瓶中，用Parafilm膜或磨 砂玻璃蓋盡可能地蓋住瓶口（稍多于1.1 g比稍少為好）。加2 mL N，N-二甲基甲酰胺（溴化氰將立即溶解）。在1 min內，將溴化氰溶液逐滴加入攪拌中的瓊脂糖漿液中。

注意：溴化氰是劇毒及揮發性物質，只能在通風櫥內特別小心地使用。小心清除所有的溴化氰廢液很重要！在通風櫥內，加固體氫氧化鈉和甘氨酸（約10?20 mg/mL)以滅活溴化氰，以相似的溶液浸泡污染的器具，讓其在通風櫥中放過夜再棄去。

23) 立即按以下方法加5μL mol/L NaOH：每10 s加30μL 至攪拌的混合物中，加10 min 直至1.8 mL NaOH加完。

為了方便起見，在反應之前，可以先量好1.8 mL NaOH溶液放到一個小管子里，這就避免了換吸頭時額外增加的10 s。

24) 馬上加100 mL冰冷的水至燒杯中，并將混合物倒入一個60 mL粗燒結玻璃漏斗中。

25) 仍在通風櫥中進行操作，用100 mL冰冷的水（<4℃)在漏斗中洗介質4次。接著 用100 mL冰冷的10 mmol/L磷酸鉀（pH 8.0)洗2次。

26) 立即將介質移入1個15 mL聚丙烯螺口蓋的管子中，加約4 mL 10 mmol/L磷酸鉀 (pH 8.0)直至介質成為均勻的稠漿。

27) 立即加入步驟19中的2份50μL DNA溶液。室溫下置于轉輪上溫育過夜(>8 h)

28) 在通風櫥內，將介質移入一個60mL粗燒結玻璃漏斗中，用100 mL水各洗2次， 再用100 mL 1 mol/L pH 8.0的鹽酸乙醇胺洗1次。

用蓋革氏計數器，比較濾出液及洗過的介質的放射活性水平，從而估計DNA結合到介質上的效率。通常，所有檢測到的放射活性都在介質中。

29) 在通風櫥內，將介質移入一個15 mL的帶螺口蓋的聚丙烯管中，加1 mol/L鹽酸乙醇胺（pH 8.0)至混合物成為平滑的漿狀。室溫下將該管置于轉輪上溫育2?4 h。

30) 在60 mL粗燒結玻璃漏斗中，依次用100 mL 10 mmol/L碟酸鉀（pH 8.0)、100 mL

1 mol/L磷酸鉀（pH 8.0)、100 mL 1 mol/L氯化鉀、100 mL水及100 mL柱儲存緩沖液洗介質。

31) 將介質保存于4℃ (至少可穩定1年，不要凍結）。

其他所需：

10 mol/L乙酸銨，25:24 : 1 (V/V/V)酚/氯仿/異戊醇，24 : 1 (V/V)氯仿/異戊醇，3 mol/L乙酸鈉 100% 及75% (V/V)乙醇，10×接頭/激酶緩沖液，6000 U/mL T4 噬菌體 DNA 連接酶（以 Weiss 單位測定；New England Biolabs)，緩沖液平衡酚，異丙醇，Sepharose CL-2B (Pharmacia Biotech)，溴化氰（CNBr Aldrich)，N N-二甲基甲酰胺 5 mol/L NaOH，lO mmol/L及1 mol/L磷酸鉀緩沖液 pH 8.0，l mol/L鹽酸乙醇胺 pH 8.0固體氫氧化鈉，甘氨酸，1 mol/L KCl，柱儲存緩沖液