滲透細胞蛋白磷酸化實驗——帶分析
本實驗討論用三磷酸核苷在可滲透細胞和分離的細胞組分體外標記蛋白的策略。這類實驗在大多數情況下還是以 [γ-32P] ATP 作為外源性磷酸供體。盡管在特殊情況下[γ-32P] GTP 也能被用于蛋白質標記。實驗方法原理檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進行研究。大多數蛋白激酶除了在細胞內還可在胞外進行許多底物的磷酸化。天然細胞的滲透化處理為得到滿意結果提供了一個有效的實驗方法，通過使用一些不同的試劑可以使細胞處于短暫的滲透狀態。這個過程使反應發生在細胞內環境，而信號轉導還能通過激素激活細胞表面受體而啟動。實驗材料待標記的培養細胞預熱研究用細胞（傳代細胞或被分離的原代細胞）試劑、試劑盒細胞培養液細胞外緩沖液有滲透性的37℃緩沖液鏈球菌溶血素 O 工作溶液ATP 儲存溶液[γ-32P] ATP研究用藥理試劑受體激動劑2 × 冰裂解緩沖液蛋白抑制劑儲存溶液儀器、耗材干冰 乙醇浴多細胞皿架 ......閱讀全文
滲透細胞蛋白磷酸化實驗——帶分析
本實驗討論用三磷酸核苷在可滲透細胞和分離的細胞組分體外標記蛋白的策略。這類實驗在大多數情況下還是以 [γ-32P] ATP 作為外源性磷酸供體。盡管在特殊情況下[γ-32P] GTP 也能被用于蛋白質標記。實驗方法原理檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進
滲透細胞蛋白磷酸化實驗
實驗方法原理 檢測出目標蛋白是磷蛋白后，可將這個蛋白質的磷酸化過程在無細胞系統或天然細胞系統中進行研究。大多數蛋白激酶除了在細胞內還可在胞外進行許多底物的磷酸化。天然細胞的滲透化處理為得到滿意結果提供了一個有效的實驗方法，通過使用一些不同的試劑可以使細胞處于短暫的滲透狀態。這個過程使反應發生在細胞內
滲透細胞蛋白磷酸化實驗
基本方案 帶分析 備擇方案1 制備用于SDS-PAGE的天然細胞樣品 備擇方案2 制備用于等電聚焦的天然細胞樣品 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 檢測出目標
滲透細胞蛋白磷酸化實驗——－制備用于SDSPAGE的天然細胞
實驗材料待標記的培養細胞預熱研究用細胞（傳代細胞或被分離的原代細胞）試劑、試劑盒2 × SDS-PAGE 樣品緩沖液細胞培養液細胞外緩沖液有滲透性的37℃緩沖液鏈球菌溶血素 O 工作溶液ATP 儲存溶液[γ-32P] ATP研究用藥理試劑受體激動劑2 × 冰裂解緩沖液蛋白抑制劑儲存溶液儀器、耗材4℃
滲透細胞蛋白磷酸化實驗——－制備用于等電聚焦的天然細胞
實驗材料待標記的培養細胞預熱研究用細胞（傳代細胞或被分離的原代細胞）試劑、試劑盒4℃ 雙向-PAGE裂解緩沖液雙向-PAGE樣品緩沖液細胞培養液細胞外緩沖液有滲透性的37℃緩沖液鏈球菌溶血素 O 工作溶液ATP 儲存溶液[γ-32P] ATP研究用藥理試劑受體激動劑儀器、耗材浴式超聲儀干冰 乙醇浴凍
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料測序級膜蛋白酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒二硫蘇糖醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?碘代乙酰
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料測序級膜蛋白酶試劑、試劑盒二硫蘇糖醇碘代乙酰胺乙酸溶液甲酸乙酰氯儀器、耗材螯合瓊脂糖凝膠層析介質實驗步驟這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見 24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串聯質譜對磷酸
磷酸化蛋白鑒定實驗
實驗材料 測序級膜蛋白酶試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇碘代乙酰胺乙酸溶液甲酸乙酰氯儀器、耗材 螯合瓊脂糖凝膠層析介質實驗步驟 這里所述的方法概括為下列幾個步驟：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性組分中的蛋白質（見 24. 3.1 )；固相金屬螯合親和層析（IMAC) 富集磷酸肽（見 24. 3. 2 )；用串
光合磷酸化化學滲透學說的實驗證據
①階段光合磷酸化實驗 指光合磷酸化可以相對分成照光階段和暗階段來進行，照光不向葉綠體懸浮液中加磷酸化底物，而斷光時再加入底物能形成ATP的實驗。1962年，中國的沈允鋼等人，用此實驗探測到光合磷酸化高能態(Z*)的存在。1963年賈格道夫(Jagendorf)等也觀察到了光合磷酸化高能態的存在
紅細胞滲透脆性實驗
實驗方法原理本試驗是測定紅細胞對不同濃度低滲鹽水溶液的抵抗力，這種抵抗力與紅細胞表面積和體積的比值有密切關系．表面積大而體積小者對低滲鹽水抵抗力較大（脆性減低）反之，則抵抗力較小（脆性增加），球形細胞表面積深/體積比值減小，脆性增加．試劑、試劑盒NaCL溶液雙蒸水儀器、耗材容量瓶試管實驗步驟一、實驗
紅細胞滲透脆性實驗
實驗方法原理 本試驗是測定紅細胞對不同濃度低滲鹽水溶液的抵抗力，這種抵抗力與紅細胞表面積和體積的比值有密切關系．表面積大而體積小者對低滲鹽水抵抗力較大（脆性減低）反之，則抵抗力較小（脆性增加），球形細胞表面積深/體積比值減小，脆性增加．試劑、試劑盒 NaCL溶液雙蒸水儀器、耗材 容量瓶試管實驗步驟
非標記蛋白質的磷酸化作用分析實驗
免疫印跡分析 化學發光法 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質樣品 試劑、試劑盒
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗
試劑的制備單層培養細胞的透化懸浮培養細胞的透化用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化用分離的亞細胞組分進行激酶分析試劑、試劑盒胞外緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?胞內緩沖液 ? ? ? ? ? ?
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗
試劑的制備 單層培養細胞的透化 懸浮培養細胞的透化 用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化 用分離的亞細胞組分進行激酶分析 ? ? ? ? ? ?
細胞破碎和蛋白質溶解實驗_?化學滲透法
實驗方法原理有些有機溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑（SDS、Triton X-100）、金屬整合劑（EDTA） 、變性劑（鹽酸胍、脲）等化學藥品都可以改變細胞壁或膜的通透性，使內含物有選擇地滲透出來。這種處理方式就是化學滲透法。本文僅以表面活性劑 Triton X-100 為例簡要介紹如下。
蛋白質磷酸化的測定實驗
代謝標記 X射線片放射自顯影檢測32P標記的蛋白質 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 細胞
使用Azurespot分析軟件定量非磷酸化與磷酸化蛋白
??背景去除背景扣除對于有效定量是必不可少的。?例如，AzureSpot有五個自動后臺選項和三個手動選項。>?如果背景不均勻，請使用?Rolling Ball。 類似指定半徑的圓盤在泳道輪廓下“滾動”，對信號求平均，從而產生平滑小的變化。 半徑越大，滾動越平滑。>?如果輪廓的末端與輪廓的其余部分沒有
使用Azurespot分析軟件定量非磷酸化與磷酸化蛋白
在上期我們回顧了使用多重來成像磷酸化蛋白的技巧，在這部分中，我們將介紹使用Azurespot分析軟件進行定量。 背景去除 背景扣除對于有效定量是必不可少的。 例如，AzureSpot有五個自動后臺選項和三個手動選項。 > 如果背景不均勻，請使用 Rolling Bal
紅細胞滲透脆性（孵育）實驗
實驗原理 紅細胞在低滲鹽溶液中，當水滲透其內部達一定程度時，紅細胞發生膨脹、破裂。觀察紅細胞在不同濃度鹽溶液中的溶血程度，可以判斷其對低滲鹽溶液的抵抗力，這種抵抗能力與紅細胞表面積與容積的比值有關，比值小者，紅細胞抵抗力較小，脆性增加。反之抵抗力增大。實驗方法 材料： 1.171.1mmol/
植物細胞滲透勢測定實驗
實驗概要本實驗介紹了植物組織滲透勢的測定原理及方法。實驗原理植物細胞的滲透勢取決于液泡的溶質濃度，因此又稱溶質勢。滲透勢與植物水分代謝、生長及抗性等有密切關系。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些植物常在細胞內主動積累溶質，以降低其滲透勢，增加吸水能力，而在一定程度上維持膨壓，保障細胞的生長和氣孔的開放，
分析磷酸化蛋白的新方法
蛋白磷酸化是重要的翻譯后修飾，在調控基因表達和細胞功能方面起著關鍵作用。檢測磷酸化時一般使用磷酸化抗體。近幾年，市場上也出現了一些新的技術和產品，可實現磷酸化的靈敏檢測。 Phos-tag?便是其中的一種。它最初由日本廣島大學醫藥分子功能科學研究室開發，后由Wako公司商業化。P
非標記蛋白質的磷酸化作用分析實驗——免疫印跡分析
鑒定蛋白質中磷酸化的氨基酸殘基是很有意義的。磷酸化作用發生在蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸和酩氨酸時，通過部分的HCl水解及接著進行雙向薄層電泳，可以便利地鑒定 標記的磷酸氨基酸。實驗材料蛋白質樣品試劑、試劑盒釩酸鈉封阻液TNTNATris·Cl疊氮鈉印度墨汁染色液TBS儀器、耗材吸水紙水浴鍋實驗步驟1.
透化細胞和退化細胞器中蛋白質的磷酸化實驗—試劑制備
試劑、試劑盒胞外緩沖液胞內緩沖液透化緩沖液標準裂解緩沖液裂解緩沖液SDS-PAGE 加樣緩沖液雙向-PAGE 裂解緩沖液實驗步驟這些試劑在后面許多地方要用到，應在進行下述實驗前配好。1. 胞外緩沖液（pH 7.2，37℃）110 mmol/L NaCl10 mmol/L KCI1 mmol/L Mg
磷酸化位點分析實驗磷酸化位點的確定
實驗方法原理 磷酸化位點的確定也使用一些通用方法；磷酸化蛋白質被純化，如果可能蛋白質要均一；磷蛋白被特異性的化學或酶反應切斷、產生肽混合物，其中含有一到兩個磷酸肽不同之處在干其分離磷酸肽的策略是為了確定氨基酸序列，定位肽段內磷酸化的殘基。上面所述的分離方法， 2D-PP 作圖、 HPLC 或 l
磷酸化位點分析實驗磷酸化位點的確定
磷酸肽的化學測序 磷酸肽的質譜分析 源后衰變 用酶和化學方法去磷酸化 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 磷酸化位點的確定也使用一
光合磷酸化的化學滲透學說
關于光合磷酸化的機理有多種學說，如中間產物學說、變構學說、化學滲透學說等，其中被廣泛接受的是化學滲透學說。 化學滲透學說(chemiosmotic theory)由英國的米切爾(Mitchell，1961)提出，該學說假設能量轉換和偶聯機構具有以下特點： ①由磷脂和蛋白多肽構成的膜對離子和質
用分離的亞細胞組分分析蛋白質的磷酸化
實驗材料樣品試劑、試劑盒胞內緩沖液透化緩沖液儀器、耗材離心管實驗步驟1. 分離細胞器。2. 于 4℃ 用胞內緩沖液清洗細胞器樣品 3 次，將相當于 1 mg 蛋白質的樣品轉至帶螺帽的小離心管，放入冰盒。3. 離心，吸去上清，加 200 μl 預熱至 37℃ 的透化緩沖液，輕輕混勻，放入 37℃ 水浴
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗
胰蛋白酶切蛋白質樣品的制備雙向薄層電泳與層析分離多肽片段反向高效液相層析繪制多肽圖譜實驗材料蛋白質 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?試劑、試劑盒甲醇 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
胰蛋白酶切磷酸化多肽作圖實驗
胰蛋白酶切蛋白質樣品的制備 雙向薄層電泳與層析分離多肽片段 反向高效液相層析繪制多肽圖譜 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 蛋白質
蛋白質磷酸化的測定實驗—代謝標記
實驗材料細胞儀器、耗材培養瓶實驗步驟1. 用 60 mm 或 100 mm 培養瓶，在完全培養基中培養細胞至所希望的密度。2. 用預熱的低磷酸培養基（無放射性磷酸鹽）沖洗兩次，然后加入含 0.5~1 mCi32P/ml 的低磷酸培養基（50~100 μmol/L 無機磷酸）。3. 培養結束后，回收?