赭曲霉毒素A的HPLC檢測（二）

飼料樣品前處理

將樣品粉碎，稱取5g試樣（精確至0.01g），分別準確加入OTA標準溶液適量，混合均勻。準確加入20ml乙腈-水（60:40）溶液，渦旋1min，超聲提取20min，在5000rpm的條件下離心10min。取上清液8ml，氨水調pH至8.0，待用。另做試樣空白對照。SPE操作過程見圖1。

儀器方法

高效液相色譜條件：Agilent 1260液相色譜儀，配FLD檢測器；色譜柱，Agilent Poroshell 120 SB-C18 （4.6×75mm，2.7μm，PN. 687975-902）；流動相，A=1%乙酸-乙腈，B=1%乙酸-水，梯度洗脫，見表1；流速，1.0ml/min；進樣量，20μl；柱溫：30℃；運行時間，12min，后運行時間為4min；FLD，Ex=333nm，Em=477nm。

圖4. OTA標準曲線。

結果與討論

樣品前處理方法的考察

OTA屬于弱酸性化合物，其結構中的苯基丙氨酸部分的pKa=4.4，所以在上樣前將提取液的pH調至8，OTA在pH大于7以上時基本以羧酸根陰離子狀態存在，在上樣時可以很好地被Bond Elut Plexa PAX以陰離子交換作用保存。然后采用4%氨水和甲醇分別洗去一些極性和非極性干擾物。試驗結果表明PAX可以對OTA進行很好的保留和洗脫，且與反相機理相比，具有更好的選擇性。

圖5. OTA標準品、空白樣品和添加回收率疊加色譜圖。

儀器方法

本文用安捷倫1260 Infinity HPLC-FLD檢測器，結合安捷倫ZL的薄殼型快速分析色譜柱Poroshell 120 SB-C18 分析OTA，主峰出峰時間為8.84min左右，方法整體運行時間為16min，在方法流動相條件下最大系統壓力僅為126bar，在連續分析幾天樣品后，色譜柱壓力沒有產生任何變化。這表明Poroshell 120系列色譜柱具有一定的耐臟性能，同時可以在常規液相色譜儀上實現高效快速分析。方法考察了樣品溶劑效應，發現將進樣體積增加到20μl時，如果用甲醇作為標準品溶劑，會具有很明顯的溶劑效應。因此直接采用流動相作為工作曲線溶劑和樣品溶劑。方法還考察了儀器的穩定性，六針重復進樣的RSD為0.74%，具有很好的重復性，見表2。經過優化后的色譜圖見圖2。

儀器方法考察了靈敏度，線性范圍及添加回收率等指標。其中靈敏度測試了1ppb濃度OTA標準品，其信噪比為10.7，結果如圖3所示。在1~100ppb濃度范圍內，測試線性相關系數大于0.9999。如圖4所示。

方法的重復性

分別向空白飼料中，加入0.01、0.05、0.1μg/kg三個添加量的OTA標樣，按照本方法的處理過程制備樣品并進行測定，OTA在飼料中的絕對回收率在85%~99%之間，RSD在1.16%~2.15%之間，見表3；標準品、空白樣品和標準添加樣品的譜圖如圖5所示，可以看出OTA經Agilent Bond Elut Plexa PAX凈化后，基本無基質干擾，可以達到很好的凈化效果并且得到很高的回收率，提高了定量結果的準確性。

小結

利用安捷倫 Bond Elut Plexa PAX強陰離子交換固相萃取結合安捷倫1260 Infinity HPLC-FLD高靈敏度高選擇性檢測器，可以實現對飼料中OTA殘留的定量分析。采用安捷倫Plexa PAX陰離子交換固相萃取，可以實現快速高效高選擇性的凈化處理，凈化后的樣品基質效應和基質干擾均很小，絕對添加回收率可達到86%以上；采用FLD分析結果表明在1ppb濃度下OTA的信噪比（S/N）=10.7；在1~100ppb濃度范圍內,線性關系和穩定性都很優異，相關系數R>0.9999。