科學家開發出超大片段DNA精準無痕編輯新方法

基因組編輯技術作為生命科學領域的一項重要突破，為基礎研究和應用開發提供了技術支撐。以CRISPR及其衍生技術為代表的編輯系統通過可編程的向導RNA引導Cas9等核酸酶靶向基因組特定位點，被廣泛應用于特定堿基和短片段DNA的精準編輯。但是，大片段DNA編輯至今仍面臨挑戰，對數千乃至數百萬堿基的精準操縱更是領域的核心難題。突破該技術壁壘，將為實現大尺度基因組操縱提供關鍵支撐——包括基因關鍵區域的替換與修復、功能基因序列的完整插入、基因簇的刪減或重定位以及人工構建基因組結構變異等。這不僅可以推動遺傳操縱技術革新，更將成為疾病治療與作物改良技術瓶頸的突破口。理想的大片段DNA編輯工具可以同時支持染色體水平的多種編輯類型，包括精準插入、替換、刪除、倒位與易位等。然而，現有工具在編輯效率、尺度、精準性及類型多樣性等方面存在不足。

近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊報道了新型可編程的染色體水平大片段DNA精準操縱技術PCE。這一技術在動植物中實現了從千堿基到兆堿基級別DNA的多種類型且精準無痕的編輯，提升了真核生物基因組的操縱尺度和能力。

位點特異性重組酶Cre-Lox系統具有染色體水平DNA操縱潛力，但其應用受到三個關鍵問題制約：Lox位點固有的對稱性導致重組反應可逆，不利于目的編輯發生；Cre酶作為四聚體工作，提升其活性的工程改造難度高；重組后特異性位點殘留，影響編輯的精準性。為突破上述限制，研究團隊構建了系統性技術路徑，實現三項關鍵技術創新。團隊開發出高通量重組位點快速改造平臺，并提出不對稱Lox位點設計原則，創制新型Lox變體，其可逆性重組活性降低至接近陰性對照水平，同時保持其原有的高效正向重組能力。進一步，基于團隊此前自主開發的融合蛋白通用逆折疊模型、結構與進化約束信息的蛋白定向進化平臺AiCE，實現對Cre蛋白多聚化界面的精準優化，獲得重組效率提升至3.5倍的工程化Cre蛋白變體。團隊創建并優化了重組酶的無痕編輯策略Re-pegRNA，利用引導編輯器的高效編輯特性，通過設計特異性pegRNA對重組后殘留的Lox位點進行“重引導編輯”，將其精準替換為原有基因組序列。

通過上述三項技術的集成優化，科研團隊構建了PCE與RePCE兩個可編程染色體編輯系統，可對不同Lox位點的插入位置和方向進行靈活編程，實現從kb到Mb尺度的大片段DNA精準無痕操縱。在動植物細胞中，研究人員利用這一系統實現了18.8 kb超大片段DNA的定點整合、5 kb序列的定向替換、12 Mb的染色體倒位、4 Mb的染色體刪除及整條染色體的易位，并利用該技術創制了含315 kb精準倒位的抗除草劑水稻種質。

上述研究開發了新型染色體編輯系統PCE，在動植物中實現了跨越kb到Mb級別的多類型染色體精準操縱。這一工具不僅能夠實現多基因疊加，而且可以通過操控基因組結構變異，為作物性狀改良和遺傳疾病治療開辟新路徑。該技術有望推動新型育種策略的發展，如通過操縱遺傳連鎖、調控重組頻率實現育性控制、消除連鎖累贅，釋放野生種質資源中優異等位基因的育種潛力。同時，精準染色體編輯技術的突破將加速人工染色體構建，在合成生物學等新興領域也頗有應用前景。

8月4日，相關研究成果以Iterative recombinase technologies for efficient and precise genome engineering across kilobase to megabase scales為題，在線發表在《細胞》（Cell）上。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、農業農村部相關項目、中國科學院戰略性先導科技專項等的支持。

論文鏈接