WesternBlot的過程與優化，著重于化學發光檢測3

六、使用化學發光底物的印跡法和操作規程的優化

6.1 使 用 化 學 發 光 底 物 的 蛋 白 質 印 跡 法

(1) 凝膠電泳分離蛋白質樣品。

(2) 制備轉移緩沖液。采 用 4 〇 0 m L 超 純 水 制 備 Tris— 甘氨酸轉移緩沖液，再加人IOOmL 甲醇。 4°C 下 使 用 和 保 存 該 轉 移 緩 沖 液 。注 ： 轉 移 緩 沖 液 ： 25 mm 〇 I/LTris、192 mmol,L 甘氨酸 (pH8_ 0),2 0 % 甲醇。

(3) 為濕轉移制作凝膠「三明治」(圖 33.8)。對于半干的轉移，在陰極和陽極間按同樣的步驟制作三明治。， : 在三明治裝配前將襯墊和濾紙浸泡在轉移緩沖液中。

⑷將蛋白質從滅膠轉移到膜上。濕轉移時如果使用為 g cmX1 〇 c m 凝設計的迷你轉移裝置，則 40 V 轉 移 90min, 并保持緩沖液溫度為4 ℃ 。半干型轉移時,15 v 轉移90 min。注: 通過凝膠染色或膜可逆染色來確定轉移是否成功。

(5) 取下膜』 在封閉緩沖液中室溫 (R T ) 搖晃孵育 2 〇?60 min ，以封閉膜上的非特異結合位點。

(6) 用 含 1 0 % 封閉液的一抗溶液孵育膜并振搖丄 h 。如果需要的話將印跡在 2?8℃過夜孵育。

(7) 清洗 膜 3 次 ，每 次 5 min』 可 用 Tris-鹽緩沖液 (TBS)、磷酸鹽緩沖液 (pBS 域 其 他

(9) 清 洗 膜 5 次 ，每 次 5 m in 以除去未能結合的酶聯物。酶聯物孵育后徹底清洗膜是至關重要的。

(10) 制備底物。使用足量底物以確保膜完全浸濕 (0.1 mL/cm2), 且膜不能變干。

(11) 用電化學發光 (ECL) 孵 育 膜 I m in, 或 使 用 SuperSignal 底物孵育 5 m in。

(12) 將膜從底物中移出并放置在塑料片保護器內。盡管塑料保鮮膜也能起作用，但是硬質的塑料片做成的保護器作用更好。移除所有在膜和膜保護器表面之間的氣泡。

(13) 通過膠片或冷 CCD 照相機進行印跡成像。

6.2 蛋白質印跡去除方案

采 用 化 學 發 光 底 物 的 眾 多 好 處 之 一 個 就 是 能 夠 移 除 所 有 檢 測 試 劑（Kaufmannet al.,1087)。這些移除方法對于沉淀底物是無效的，并且用于熒光染料顯色的膜時結果各異。

(1) 制備蛋白質印跡膜剝離液。使用下述剝離液中的一種：

① Restore W estern Blot Stripping Buffer(Therm o Fisher Scientific 公司產品）

② 0?I m o l / L 甘氨酸- H C K p H 2. 5?3. 0);

③ 50 m m o l / L Tris-H C l (p H 7 ) 、2 % S D S 、50 m m o l / L D T T 。 注 : 現 配 現 用 。

(2) 將待除去印跡的膜放在蛋白質印跡剝離液中。使用足量溶液確保膜完全潮濕(每 8 c m X 10 c m 膜對應約 20 m L 剝離液)。注: 可能會出現一些靶蛋白的變性和損失。

(3) 室溫孵育 5?15 m in。為追求最佳結果，需要優化孵育時間和孵育溫度。某些相互作用至少需要 15 m in, 可能還需要 37°C 孵育 。如果使用緩沖液③,70°C 孵 育 30 m in。

(4) 將印跡從蛋白質印跡膜剝離液中移出，用洗滌緩沖液清洗 (P B S / T B S 或其他含有 0.0 5 % T w e e n - 2 0 的生理緩沖液）。

(5) 要測試酶聯物和一抗是否完全移除, 可進行下列實驗。若兩種情況下都能檢測到信號，就重復步驟 (2)?(4)，剝離時間額外增加 5?15 m in 或 將 溫 度 提 高 至 37°C 。優化去除時間和溫度以確保在不損傷抗原的同時將抗體完全移除

① 要測試酶聯物是否完全移除, 將膜用底物孵育并印跡成像。 5 m m 膠片曝光后若沒有信號被檢測到，那么表示酶聯物已經被成功移除。

② 要測試一抗是否完全移除，將膜用酶聯物賻育并用洗滌緩沖液清洗。再用底物孵育并印跡成像。 5 m in 膠片曝光后若沒有信號被檢測到，那么表示一抗已經被成功移除。

確定膜已經恰當地剝離以后, 開始進行第二次檢測實驗。通常，印跡可以被剝離和再檢測數次, 但可能會需要更長的曝光時間或更敏感的底物。如果抗原不穩定, 之后的再檢測可能會導致信號衰減。需要對單獨系統進行分析。注: 剝離后通常不需要再次封閉薄膜 ，但在某些系統中卻需要這么做。

6.3 抗 原 來 度 的 優 化

(1) 用 SDS^ A G E 樣品緩沖液制備不同濃度的蛋白質樣品。測試較大范圍的蛋白質濃度，需要注意所使用底物的檢測極限。

(2) 凝膠中每種濃度的樣品要等量，通過電泳進行分離。將樣品轉移到膜上。

注 ： 最佳濃度的粗指示可使用點印跡。使用盡可能少的量將抗原稀釋物點在干燥膜條上。使膜干燥 5?10 m in 或直到沒有可見潮濕痕跡，再進行步驟 (3)。

(3) 用標準封閉試劑封閉膜，加入一抗, 隨后將酶聯物結合膜。如果還沒有確定最優稀釋度，就根據底物敏感度采用中等范圍的稀釋度。

(4) 清洗膜，加入底物。按要求進行印跡成像。

6.4 膜 封 閉 的 優 化

(1) 用電泳分離蛋白質樣品并轉移至膜上，或如先前所述將蛋白質樣品點在膜上。

(2) 根據待測試的條件的個數，將膜條從膜上切下來。下述組合物應該用每一種封閉劑測試。①封閉劑+ —抗 + 酶聯物+ 底 物 ；② 封 閉 劑 + 酶 聯 物 + 底 物 ；③ 封 閉 劑 +底物。

(3) 將膜條加入到各種封閉液中, 確保其完全浸泡在溶液中。每個膜條都室溫振搖孵 育 I h 。

(4) 在各組中加入含 10% 封閉劑的一抗和/或酶聯物。如果還沒有確定最優稀釋度，就 根 據 底 物 敏 感 度 采 用 中 等 范 圍 稀 釋 度 。

(5) 清 洗 膜 ，加 入 底 物 。按 要 求 進 行 印 跡 成 像 。

注 ：將 封 閉 后 的 膜 用 底 物 孵 育 , 以 檢 査 封 閉 劑 或 樣 品 中 內 源 的 過 氧 化 酶 活 性 。如 果檢 測 到 信 號 ，就 在 封 閉 步 驟 后 使 用 其 他 的 封 閉 緩 沖 液 或 使 用 過 氧 化 酶 抑 制 劑 。封 閉 緩 沖液 用 量 大 時 會 最 大 限 度 地 減 少 非 特 異 信 號 。

6.5 — 抗 農 度 的 優 化

( 1 ) 電 泳 分 離 蛋 白 質 樣 品 并 轉 移 到 膜 上 。或 者 ，如 本 章 6. 3 節 所 述 將 蛋 白 質 樣 品 點在 膜 上 。用 適 當 封 閉 劑 封 閉 膜 。根 據 待 測 試 的 一 抗 條 件 的 個 數 將 膜 條 從 膜 上 切 下 來 。

(2) 在 含 1/10 體積封閉劑的清洗緩沖液中制備一抗的稀釋液，并將其加人到膜條上 。室溫孵育 I h。

(3) 清 洗 膜 條 ，室 溫 下 用 酶 聯 物 孵 育 l h 。再 次 清 洗 并 用 適 當 的 底 物 顯 現 信 號 。用 膠片 或 C C D 照 相 機 檢 測 信 號 。

注 ：先 用 一 抗 工 作 液 孵 育 膜 ，再 用 酶 聯 物 工 作 液 孵 育 ，以 檢 查 一 抗 與 封 閉 劑 的 非 特 異性 結 合 。如 果 觀 察 到 信 號 ，通 過 使 用 其 他 的 封 閉 劑 或 較 少 量 的 一 抗 來 解 決 此 問 題 。

6.6 膜 清 洗 的 優 化

⑴ 使 用 洗 滌 緩 沖 液 ，如 P B S 或 T B S 或 其 他 含 0. 05% tween2 0 的 生 理 緩 沖 液 。

(2) — 抗 孵 育 后 , 振 搖 清 洗 膜 至 少 3 次 , 每 次 5 m m ; 酶 聯 物 孵 育 后 ，振 搖 清 洗 膜 至 少 5次 ，每 次 5 m i n 。

(3) 如 果 在 最 終 檢 測 中 出 現 非 特 異 性 背 景 ，使 用 更 大 量 的 洗 滌 緩 沖 液 或 增 加 每 次 清洗 的 用 量 和 時 間 。如 果 仍 沒 有 改 善 , 問 題 就 在 于 其 他 變 量 。

6.7 酶 聯 物 農 度 的 優 化

當檢測一個新的蛋白質印跡系統的最佳濃度時， 一 個簡單的實驗通常可以補救許多因信號變動帶來的問題。

(1) 在 3 個 (或更多) 凝膠孔中加入同樣用量的目標物。

(2) 電泳分離蛋白質樣品并轉移到膜上。封閉非特異結合位點，結合一抗。

(3) 清洗后，將含目標物的印跡切成膜條。

⑷以不同酶聯物濃度結合膜條。例如，X 寸于 SuperSignal West Pico Substrate 使用1 : 40 000、1 : 60 000 和 1 : 80 000 的稀釋度 (取自 I mg/mL 儲備液）。室溫下振搖孵育條 帶 I h。

(5) 清洗膜條，加入底物。底物孵育后，進行膜條成像。

(6) 等 待 1?2 h，再次進行膜條成像。

(7) 結果評估。選取能產生最強信號的稀釋度。

6.8 檢 測 方 法 的 優 化

(1) 電泳分離蛋白質樣品并轉移到膜上，或 如 本 章 6. 3 節描述將蛋白質樣品點在膜 上 。

(2) 封閉非特異結合位點，在 含 有 1/10 封閉劑的體系中結合一抗和酶聯物。

(3) 如果抗體濃度尚未優化，選擇一個中等范圍的稀釋度。每次孵育后都要清洗膜。

(4) 根據待測試的底物曝光條件的個數從膜上切下膜條。制備待測試的底物工作 液 。

(5) 以制造商說明為準，用底物孵育膜條一段時間。

(6) 用鑷子將底物中的膜條移出，在紙巾上輕拍條帶邊緣以移除過剩的底物。

(7) 將膜條放在塑料薄膜上, 按不同時間長度對其成像。選取一個有清晰信號和低背景的時間。注:CCD 照相機可能比膠片需要稍長的曝光時間。