WesternBlot實驗操作進階技巧（一）

　　除非是Western blot實驗方面的高手，要不就像在我看來，Western blot發展至今好像與其1979年剛被發明出來的時候一樣一樣，同樣也是根據蛋白不同的大小（或電荷）進行電泳分離，然后轉膜，利用抗體篩選出目標蛋白。

　　多年來這種技術已經成為了蛋白研究方面的一種主要技術，研究人員可以利用Western blot定性，甚至半定量的識別組織和培養細胞中的蛋白，這種操作實驗可以說每天都會在實驗室里上演，但同時，Western blot等blot技術也是各種審議的主題，學術造假，以及一些研究成果被退回的原因。

　　近年來Western blot技術也有了一些發展，一些新的試劑和儀器令Western更為敏感，一些主要步驟（電源，轉膜等）也更為精簡，雖然許多研究人員仍然使用的是化學發光法檢測法和X光膠片，但一些新的技術，如數字熒光成像技術已經提高了這種工具的敏感性和可靠性，令其進入了“定量時代”。一些新的技術方法也能令Western blot可以用于單細胞檢測，或者對有限及珍貴的樣品進行檢測，其中的一些步驟也實現的自動化。

　　減少樣品量

　　過去幾年里，研究人員已經邁出了檢測單個細胞中DNA 和 RNA的重要一步，相比之下，蛋白檢測已經落在后面。蛋白抗體質量不過關是主要的原因，這限制了研究人員在使用流式細胞儀和免疫細胞化學方法進行單細胞蛋白水平檢測的精確度。而且Western blot實驗需要分離得到蛋白，然而迄今為止這在單細胞中還無法做到。

　　來自加州大學伯克利分校的生物工程研究組Amy Herr等人研發出了一種新型的微流控設備：scWestern （即single-cell Western），這種設備可以幫助研究人員在四小時內完成大約2000 個體細胞的Western實驗。

　　從結構上來說，scWestern 包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺（PA）凝膠，而芯片上共有6720個微孔。這些微孔的直徑為20 μm，是在聚丙烯酰胺凝膠聚合時形成的。

　　從設計原理上來說，scWestern實現了高度平行的分析，而不需要單獨獲取每個細胞。通過被動重力驅動的細胞設置，細胞懸液接種到微孔中，每個微孔在5-10分鐘內捕獲0-4個細胞。而且研究人員通過優化短分離距離的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），實現了高密度的scWestern芯片。在細胞裂解后電泳開始，他們在浸沒的scWestern玻片上應用電場，電泳蛋白穿過微孔壁，進入薄的凝膠層。其次這一設備利用了反應（蛋白質固定）和運輸（抗體雜交）的小特征長度。在PAGE之后，蛋白質與PA凝膠交聯。之后進行抗體雜交和檢測。

　　研究人員應用這種方法來研究體外刺激下的干細胞信號和分化反應，結果發現scWestern能定量每個單細胞中最多11種目標蛋白，在與FACS整合時，支持稀有或珍貴細胞（~200個）的分析。

　　如何入門：

　　雖然這項技術是全新的，但是一般來說通過多次練習，剛畢業的學生在一個月內就能掌握這種技術，Herr說。

　　同時Herr也與Zephyrus Bioscience公司合作，計劃于明年推出相關的自動化設備。

　　注意事項：

　　不過需要注意的是這種技術有兩個限制。其一是細胞裂解后，蛋白會從微孔中漏出，造成高達40%的損失。其次是分離度欠佳，研究人員無法區分質量相差至少一半的蛋白。Herr研究組目前正努力解決這兩個問題，“我想我們已經有了一些令人高興的結果，”她說。

　　微western芯片分析技術（Microwestern，生物通注），比如Herr的“μWesterns”（scWestern之前的一個成果，比scWestern孔徑大）則能幫助那些進行細胞群體研究，而不是單細胞研究的研究人員，這種方法是在一個96孔板上將細胞裂解液放到96個微小的凝膠塊中，具體過程可以通過YouTube視頻來看（www.igsb.org/services/mwac-methodology）。微western芯片分析能區分質量相差75kD的蛋白（蛋白質量超過200kD），同樣也需要piezoelectric dispenser，而這并不便宜。

　　費用：

　　相關儀器的價格待定，如果你需要制造自己的 scWestern，那么就需要花費幾千美元（其它材料準備充分），而微western芯片的價格則為每次1,800美元（當地價格）——96個抗體檢測六種細胞裂解液。