【分享】影響westernblot實驗的七大因素

　　Western blotting是一個步驟繁多的實驗，實驗中的每一步都會對最后的結果產生影響，電泳過程是第一步，也是很重要的一步，好的電泳能讓目的條帶整齊，就像人工畫的。以下是總結的一些影響實驗結果的因素：

　　1. 樣品質量。所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結果的可靠性有影響。

　　2.凝膠質量。不連續SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，具體的影響因素有：（1）分離膠的PH值應在8.8左右，而濃縮膠的PH應在6.8左右，最好不要差過0.5個PH單位，因為這個PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩定是很重要的。（2）用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時間，不純的丙烯酰胺會含有丙烯酸，它會影響到凝膠內部局部PH環境，因此會影響電泳的效果，沒有聚合充分的凝膠會含有游離的丙烯酰胺，也會影響到局部PH環境，它們還會與蛋白上的氨基、巰基以及酚羥基反應影響蛋白的泳動。凝膠聚合時間以分離膠>45min，濃縮膠>20min為宜。此外，單體放置時間過長也會造成丙烯酸的累積。（3）凝膠母液混合是否均勻也會影響到凝膠濃度的分布。（4）配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會影響到網孔的大小，因此也會對電泳的質量有影響。（5）APS及TEMED的加入量，APS極易潮解而失去活性，因此最好是現用現配，APS不宜加入過多，否則會氧化蛋白樣品。（6）點樣孔底部要平整。

　　3. 點樣。樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因為電泳液PH值為8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH值，進而影響濃縮效果。因此，建議點樣最好用長槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。還有，加樣之前最好先沖洗一下加樣孔

　　底部，減少沒有聚合的丙烯酰胺的影響。盡量從加樣孔的中間點樣，這樣能使得樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻，這也會對最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過高或過低，過高會影響條帶的形狀，過低不利于后面的雜交反應。

　　4. 電泳緩沖液。盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強度的穩定。

　　5. 電壓條件。電壓過高，一方面會使凝膠溫度上升，改變凝膠內部PH值，甚至會造成溶膠，另一方面，電流過大也不利于蛋白分子的分離，容易造成條帶變形，電壓過低，又會有樣品擴散的影響。我們經常用的濃縮時80V，分離時100V比較好，條帶很平。

　　6. 轉膜。首先是膜的選擇，主要從實驗目的和實驗要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序，則非PVDF膜不可，因為只有PVDF膜才能經受住嚴酷的清洗條件。其次是轉膜方法的選擇。主要有半干法轉膜和濕法轉膜。半干法操作要求高，但效率也高。濕法操作要求相對低，花時間多一些。

　　7. 抗體雜交與底物顯色。一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標蛋白；二抗一般都是效價很高的，只要室溫下雜交1小時就可以了，適當延長也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學反應底物。如英格恩生物的超敏型ECL發光液Enlight-Plus，檢測級別可達pg級，發光時間長，穩定。