Western印跡法檢測蛋白

實驗概要

Western印跡法檢測蛋白的敏感性約為1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板的一個孔可上總蛋白量約為100μg，所以只要被檢蛋白不低于總蛋白量的萬分之一，即可被檢測出來。如果所分析的樣品為未知時，應同時作陽性對照。雜交技術主要有NC膜的封閉，靶蛋白與第一抗體的反應，結合靶蛋白的一抗與二抗的反應，顯色等幾部分構成。

實驗原理

該技術的原理及過程主要為轉移到NC等膜上的蛋白帶。用其它蛋白作為封閉液，將膜上余下的其它蛋白可結合點封閉。加入與待檢測目標靶蛋白有特異性的第一抗體，經免疫反應，一抗將與目標蛋白結合，再經用洗膜液洗滌后，膜上僅在靶蛋白上結合有第一抗體。再加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應，反應后，經洗膜液洗滌，二抗就僅存在于結合靶蛋白的一抗上。因為這種二抗都為酶標抗體，所以通過酶標反應，在顯色液中，膜上結合靶蛋白－一抗－二抗的位置即將呈現一定的顏色。

主要試劑

封閉液（TBST，3％BSA）

漂洗液 TBST（10mMTris-HCL，pH8.0，0.15mMNaCL，0.05%Tween-20），PBS(0.8%NaCl，0.02%KCl，0.144%Na₂HPO₄ 0.024%KH₂PO₄ pH至7.4)

辣根過氧化物酶顯色液(可用Ⅰ或II)

Ⅰ 取6mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 溶于9ml  100mM Tris-HCl(pH7.6)中，加入1ml 0.3%(w/v)的NiCl₂或CoCl₂。過慮去除沉淀。取10ul  30%雙氧水與上液充分混勻

注意，此液必須新鮮配制。

II  取20mg，4-chlor-1-raphthol于20ml冷甲醇中，另取60μl30%雙氧水，混勻。

注意，此液必須新鮮配制。

堿性磷酸酶顯色液

    5％NBT溶液 （溶于70％二甲基甲酰胺中）  66ul

    5％BCIP溶液（溶于100％二甲基甲酰胺中）  33ul

堿性磷酸酶緩沖液 100mMNaCl  5mMMgCl2  100mMTris-HCl(pH 9.5)

以上三者充分混勻，需要在30分鐘內使用完。

主要設備

塑料封口機  搖床

實驗步驟

1. NC膜漂洗，NC膜用TBST緩沖液漂洗一次

2. NC膜的封閉

NC膜與蛋白質的結合無任何特異性，因此作為特異性檢測靶蛋白的探針－一抗蛋白也能與NC膜結合，而一旦這種結合情況發生，當加入二抗后，背景上將出現許多非特異性條帶，而則勢必造成目標蛋白的不可檢測性。因此Western印跡技術的敏感性、可行性將取決于能否對NC膜上一些蛋白質潛在結合位點進行有效封閉。在實際操作中這些結合位點一般用脫脂奶粉封閉，也可用血清白蛋白封閉。如果操作中加蛋白封閉后，非特異性背景仍很大的話，則可在封閉液中加入Tween20，Tween20的存在，能降低背景噪聲，且不影響抗體與靶抗原的結合。

將Ａ中經電轉移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封閉液（液面需蓋過膠面）室溫下輕輕遙蕩2-3小時。

2. 目標靶蛋白與第一抗體的反應  

一抗的稀釋：將第一抗體用封閉液稀釋，稀釋度由預實驗確定，但可參考下列數據：多克隆抗體，1:100-1:5000  培養的雜交瘤細胞上清液，1:100  鼠腹水細胞1:1000-1:10000

3. 將Ｂ中封閉好的NC膜，放入塑料袋中，加入一抗，加入量為0.1ml一抗/cm²

NC膜，趕盡塑料袋內所有氣泡，封口機封口，４℃下輕輕震蕩２小時。

注意，在室溫下，延長反應時間，可增加靶蛋白的可檢出量，但也會增加非特異性結合，加大背景噪聲。

4. 洗膜。反應完畢后，將塑料袋剪開，棄去反應液，用PBS洗三次，每次10分鐘。

5. 靶蛋白－一抗復合物與二抗反應

   1) 將膜從PBS溶液中轉至TBST溶液中，室溫下輕輕震蕩１０分鐘。

此操作是為了去除NC膜上的磷酸及疊氮鈉

   2) 將二抗用二抗稀釋液稀釋，稀釋度一般為1:200-1:2000。

   3) 將膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般為0，1ml二抗溶液/cm²膜，封好塑料袋，在室溫下輕輕震蕩１小時。

6. 剪開塑料袋，取出NC膜，在TBST溶液中沖洗1-5次，每次１０分鐘。

7. 顯色 

   1) AP系統

      a. 將膜放入堿性磷酸酶顯色液（10ml堿性磷酸酶緩沖液，66ulNBT，33ulBCIP）中，室溫下輕輕搖動。

      b. 待條帶出現后（約顯色20分鐘），將膜放入200ul0.5MEDTA(pH8.0)和50mlPBS溶液中

      c. 照相

   2) 辣根過氧化物酶系統

      a. 將膜放入顯色液中，室溫下輕輕搖動。

      b. 待條帶出現后（約顯色1－3分鐘），立刻用水洗膜，然后轉入PBS中

注意，此顯色帶在陽光下幾小時即褪色

      c. 照相