FarWestern分析蛋白質相互作用實驗

實驗方法原理

實驗材料 待分析的樣品編碼目的蛋白的 cDNA（已經克隆到體外表達載體中）

試劑、試劑盒 1 × SDS 上樣緩沖液麗春紅 S 染液封閉緩沖液 I封閉緩沖液 II體外轉錄 翻譯試劑盒PBS35S-甲硫氨酸探針純化緩沖液探針稀釋緩沖液

儀器、耗材 微量過濾離心柱聚偏氟乙烯（PVDF）／硝化纖維膜（NC）

實驗步驟

封閉緩沖液 I： 0.05%（m/V）吐溫-20 溶解到 1 × PBS 緩沖液中，新鮮配置

封閉緩沖液 II： 1 g 牛血清白蛋白（BSA；fraction V）溶解到 100 ml 1 × PBS ，新鮮配置

1. 準備待分析蛋白樣品，將之融解到 1 × SDS 上樣緩沖液中。

2. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣本。

3. 用半干印跡法將蛋白質從膠上轉到固體支持膜上（如 PVDF 或者硝化纖維膜））。

4. 可選步驟：轉膜后，用 100 ml 新鮮稀釋的 1 × 麗春紅 S 染液染膜 5 min。染膜時要用能夠容納膜的足夠大的容器，足夠多的麗春紅 S 染液，能夠完全沒過膜表面。

5. 褪色：使用去離子水洗膜數次直至蛋白質能夠清晰顯現。用鉛筆在重要的蛋白條帶上做上標記以便以后參考。剪掉膜的多余部分。

6. 在水中再褪色 5 min 直到紅色染料變淡。

7. 室溫下在 200 ml 封閉緩沖液 I 中封閉 2 h，輕輕搖晃。

8. 輕輕倒掉溶液，加入 200 ml 封閉緩沖液 II。同步驟 7 —樣孵育。

9. 倒掉封閉緩沖液 II，在 100 ml 1 × PBS 中輕輕漂洗。

10. 下面按廠商步驟制備用 35S-甲硫氨酸放射性標記的目的蛋白的體外翻譯探針。

11. 翻譯后，使用 500 W 探針純化緩沖液稀釋，室溫下使用微量過濾離心柱 10000 g 離心 15~30 min 純化探針。保存部分的純化探針用于 SDS-PAGE 電泳分析（如 2 μl）和閃爍計數（如 2~5 μl）。

12. 用 50 ml 1 × 探針稀釋緩沖液（沒有探針）預孵化膜 10 min，室溫下伴輕搖。

13. 用 1 × 探針稀釋緩沖液稀釋翻譯的探針，使其體積足以沒過膜（通常 3 ml）。

14. 將探針加到膜上，室溫下孵育 2 h，在結合反應過程中轉動試管（若在試管孵育）或搖動封口袋（若在封口袋孵育）。

15. 將膜轉移到一個塑料盤中，室溫下使用 200 ml 1 × PBS 洗膜 5 min。

16. 風干膜，在 X 射線膠片（放射自顯影）或者磷屏曝光成像。

注意事項

1. 當使用放射性材料時，必須有適當的安全防護措施。

2. 在接觸支持膜時一定要戴手套或者用夾膜鉗。