CART逆轉TGFβ免疫抑制作用

　　以往的CART都是識別結合表達于腫瘤細胞表面的抗原，此次整理分享的文章，作者設計了識別可溶性抗原的CART細胞，并對CART激活過程中CAR在結構層面的變化進行了研究，具體內容如下：

　　可溶性的CD19能激活CD19 CART細胞（CD69表達上調、細胞因子生成增多）

　　電泳發現CD19以單體和二聚兩種形式存在，再結合前人研究成果，文章作者推測二聚形式的配體可能對受體激活有某種意義

　　為了驗證二聚化配體對于CART激活的作用，文章作者設計了GFPCAR系統，并制備了單體GFP和二聚GFP兩種配體

　　只有二聚化GFP配體能激活CART細胞，暗示配體可能調節受體二聚化

　　電泳結果顯示CAR在未激活狀態下以單體和二聚兩種形式存在，說明受體自身二聚化并不足以激活產生信號

　　基于上面的實驗結果，作者又設計了兩個GFP CAR，分別識別不同的GFP表位，推測單體形式的GFP通過兩個表位可以把CAR“拉”到一起  -配體調節受體二聚化

　　只表達識別單一表位CAR的細胞無法被單體EGFP激活，但當兩種CAR同時表達于細胞后，EGFP即可激活細胞，暗示配體通過調節受體二聚化激活細胞

　　以鈣流為指標看信號激活，顯微鏡觀察發現信號的激活不依賴細胞接觸  -可溶性配體可激活CART細胞

　　上面達到可溶性配體通過誘導受體二聚化可激活CART細胞，怎么應用這個呢？TGF-β是存在與實體瘤微環境中的免疫抑制分子，如果能設計一個識別結合它的CART，利用TGF-β激活CART細胞豈不就逆轉了其免疫抑制作用，文章作者從三個TGF-β單抗中“拆出”scFv段，3個scFv均能阻斷TGF-β信號

　　選取阻斷信號能力最強的scFv段設計CAR

　　TGF-β無法在表達TGF-βCAR的細胞上激活其信號（磷酸化SMAD2），反而激活了CART細胞的NFAT和NFkB信號

　　TGF-β無法在發揮免疫抑制作用，反而促進TGF-βCART細胞激活、產生細胞因子

　　TGF-β功能被逆轉：促進TGF-βCART細胞擴增

　　TGF-β以同源二聚形式存在，那么它識別結合CAR必然存在以上三種模式：1、把兩個細胞“拉”到了一起，2、把同一個細胞兩個CAR“拉”到了一起，3、1和2同時存在。這三種模式激活信號對于細胞濃度依賴性不同

　　用NFAT-EGFP報告系統驗證，發現高細胞密度利于CART細胞激活，低密度下CART細胞亦可激活（d：無需細胞間互作）

　　研究CART細胞被激活后CAR的空間分布：激活后CAR會聚簇

　　激活后CAR會聚簇與ZAP70共定位（ZAP70定位于膜附近，是TCR的一部分，對于T細胞信號傳遞起重要作用），暗示CAR聚簇對于細胞激活意義重大

　　研究影響CAR聚簇的因素：突變胞外連接scFV段和跨膜區肽段中能形成二硫鍵的半胱氨酸并不影響CAR聚簇

　　研究影響CAR聚簇的因素：胞內區突變也不影響聚簇，用抑制劑抑制微絲則影響CAR的聚簇，暗示是CAR的聚簇是微絲依賴的

　　到這里作者發現：1、配體調節受體二聚化，2、受體在缺失配體的情況下二聚化不足以激活信號，3、配體結合受體后受體空間分布發生變化且與信號傳遞關鍵蛋白共定位！文章作者推測CAR信號的傳遞是一種力傳導  -配體與受體結合后引起受體二聚化對受體有個拉力，這個拉力使得位于胞內的信號段伸向胞漿，利于胞內信號段域各種下游分子接觸、傳遞信號

　　既然是力傳導，對于傳遞力、連接scFv和胞內區的那個“繩子”長短肯定有一定影響，作者設計了兩個“繩子”長度不同的CAR，發現長度并不影響CAR的表達水平

　　以GFP報告系統看“繩子”長度對于TGF-βCART激活的影響：短“繩”更利于力的傳導，CART細胞的激活

　　以細胞因子生成看“繩子”長度對于TGF-βCART激活的影響：短“繩”更利于力的傳導，細胞因子的生成

　　文章作者以不同的視角、巧妙的設計了逆轉TGF-β免疫抑制作用的CART！在可溶性抗原這個體系里研究配體（抗原）與受體（CAR）的互作，發現了抗原誘導CAR二聚化、聚簇，通過力傳導信號！更進一步發現胞外連接scFV“繩子”長短對于信號傳遞的意義  -讓我們對CAR的認識變得更加細膩！