酵母雙雜交實驗

實驗概要

本實驗構建了Bait載體和prey載體，酵母雙雜交后，應用CPRG法定量測試了蛋白質相互作用。

實驗步驟

1. Bait載體的構建

將高保真PCR擴增的OsCCTlb(引物為OsCCT1bEcoRI5'和OsCCTlbXhoI3')和OsCNTlb(引物為OsCNTlb   EcoRI5'和OsCNTlbXhoI3')基因片段用EcoRIlXhoI雙酶切后連接入pLexA的EcoRI/XhoI位點。DNA測序正確后用于實驗。

2. prey載體的構建

用高保真聚合酶擴增OsCRYlb(引物為OsCRYlbEcoRI5'和OsCCTlbXholI3')和OsCOPl缺失第1-162個氨基酸的片段OsCOPl⊿l-162(引物為OsCOP1487EcoRI5'和OsCOP1XhoI3')。PCR產物用EcoRIlXhoI雙酶切后分別連接入pB42AD的EcoRI/XhoI和EcoRI/XhoI(平端)位點。DNA測序正確后使用。

3. 酵母雙雜交

   1) 搖菌(準備轉化用)

45mLYPD加5mL 20%葡萄糖(Glucose)。加入100uL EGY48酵母菌，搖一天。

   2) 轉化(一步法)

      a. 取酵母菌液1.5mL于Eppendorf管中，12，000rpm離心1 min。

      b. 用槍吸盡上清液，加入one-step buffer 100微升。

      c. 吹打勻后加入到混合液(carrier DNA 6uL，pSHI18-34 5uL，bait 3uL，prey2.5uL)中，震蕩混勻，45℃水浴30min。

      d. 涂板(生長培養基加Glucose加AA-His-Trp-Ura )，30℃放置3天左右。

   3) 挑克隆

每個樣品挑10個于1mL液體生長培養基培養一天(30℃，220rpm )。

   4) 誘導

從搖出的菌液分別取100ul放入2mL誘導培養基中培養13小時左右，OD值大約為0.8到0.9。

   5) CPRG法定量測試蛋白質相互作用

      a. 取誘導出的菌液1mL，13，000rpm離心1 min，棄上清。

      b. 加入1 mL buffer 1，震蕩混勻，離心1 min。

      c. 棄上清，留下大約100uL，震蕩混勻。

      d. 液氮速凍1 min，放37℃水浴1 min，然后再放液氮1 min，放37℃水浴1 min。

      e. 加入900uL buffer2(這里開始計時)，震蕩混勻，離心1 min，取出上清加入到比色杯中。

      f. 計時到l0min分鐘時加入0.5 mL 3 mM的ZnC1₂，吹打均勻。

      g. 測其OD值(578nm)和菌液OD值(600nm)。

得出的數值套入公式：Units=1000xOD578/elapsed time (min) x Volume (mL) x OD₆₀₀即可計算出兩蛋白相互作用值。

注意事項

在本實驗中，由于本底非常高，所以在進行CPRG法測試前將所有菌液稀釋10倍后再做分析。