蛋白質免疫印跡（WesternBlot）（一）

Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的方法。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。

經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

蛋白質樣品

丙烯酰胺 SDS  Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考馬斯亮蘭 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒

電泳儀 電泳槽 離心機 離心管 硝酸纖維素膜 勻漿器 剪刀 移液槍 刮棒

一、試劑準備
 

1.  SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。
 

2.  勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH₂O 2.8 ml。
 

3.  轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH₂O定容至1000 ml。
 

4.  0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na₂HPO₄ 1.44 g；KH₂PO₄ 0.24 g；加ddH₂O至1000 ml。
 

5.  膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH₂O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
 

6.  顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H₂0₂ 1.0 μl。