細胞凋亡的形態學觀察

細胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根據某些單個細胞死亡時細胞碎裂如花瓣或樹葉散落般的形態學特征。目前對細胞凋亡的認識正不斷得到深化，檢測凋亡細胞的方法也逐漸增多，但形態改變仍是確定細胞凋亡的最可靠的方法。
一、光學顯微鏡觀察
凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀察，作為分析指標之一。
檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。
二、視頻時差顯微技術（video time-lapse microscopy）
本方法用于細胞培養，通過相差顯微鏡可動態觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現釘狀突起，特續數小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續觀察，本方法可養壑培養中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。
檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態改變，每隔分鐘 30秒作序列攝影，連續24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
三、電子顯微鏡觀察
關于凋亡細胞的超微結構特征，包括透射電鏡和掃描電鏡下的改變，在許我文獻中已有詳盡描述。凋亡細胞的典型形態改變如胞質的固縮，染色質濃縮成半月形或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡小體形成等，在透射電鏡下得到最佳的體現。為凋亡細胞判定提供了最可靠的依據。本方法的缺點是樣品制作過程較復雜，且儀器、設備的費用昂貴，較難廣泛大量開展。由于樣品范圍局限，在凋亡細胞數較少時需進行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變。還應指出的是，在觀察體外培養的凋亡細胞時，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡細胞時，常可見到各階段的改變，并可見到較多典型的凋亡小體很少見到，出現較多的是凋亡初期胞體收縮、染色質邊聚和后期凋亡小體（或整個凋亡細胞）被吞噬和降解的現象。一些不典型的改變容易被忽略，在觀察時要特別予以注意。
檢測方法：透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
四、流式細胞技術
流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu- larity）有關。細胞凋亡過程中出現的形態改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發生改變。早期凋亡細胞主要表現為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。
細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞 DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。
檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。