細胞凋亡及其檢測技術1

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（PCD）,是細胞衰老自然死亡的主要方式之一，在機體中承擔著重要的調控作用。它不僅在維持細胞群體數量的穩定、胚胎發育和免疫系統的克隆選擇方面，而且在腫瘤發生、發展、抗腫瘤藥物的治療等方面具有十分重要的作用。
細胞凋亡是由基因編程控制的細胞主動參與的自殺過程沒事一種生理性調節機制，與細胞壞死的死亡機制是完全不同，與細胞凋亡相關的癌基因和抑癌基因有兩類，一類是促進凋亡的，如C-myc、野生型p53、Fas和Fasl、bcl-xs、ICE、bak、bad等；另一類是抗細胞凋亡的，如突變型p53、bcl家庭的bcl-2、bcl-XT及病毒來源的BHRF1等，這兩類基因與調控細胞凋亡密切相關。在腫瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表達，將會導致腫瘤的發生和惡化，用藥后受抑，表明藥物療效好，預后佳，腫瘤發生與發展受抑制。反之，若促凋亡基因受抑，腫瘤則發生和發展。如果抗凋亡的基因活化和高表達將促進腫瘤的發生與發展，會導致腫瘤細胞耐藥、預后不良；反之則腫瘤的發生與發展受抑，對放療、化療敏感，療效好。由此可見，研究細胞凋亡不僅對研究組織和細胞的分化有理論價值，而且對腫瘤的發生和發展及臨床治療均有指導意義。

一、細胞凋亡的特征
細胞凋亡的特征是內源性核酸內切酶的激活，染色質DNA被有規律的切成整數倍的核小體片斷，凝膠電泳呈梯形圖像，電鏡下可見有形態學變化，如細胞皺縮、胞膜完整，胞漿致密，染色質濃縮成新月形并斷裂，有核膜包繞含核碎片的凋亡小體形成。經4，6-二脒基二苯基吲哚（DAPI）熒光染色，可見有細胞固縮，核斷裂后形成大小不等的塊狀或顆粒狀的熒光碎片。由于核斷裂后形成小片斷可透過膜而丟失，僅剩下大片斷在流式細胞儀檢測細胞周時可測出，稱“G1”期的AP峰（即凋亡峰）。

二、細胞凋亡的分子機制
細胞凋亡是一個非常復雜的生理和病理過程，機體內多種因素可影響細胞凋亡的發生，如鈣離子、鎂離子、糖皮質激素能促進細胞內源性核酸內切酶活性，促進細胞凋亡，而鋅離子能顯著抑制鈣離子和糖皮質激素這種誘導凋亡的作用，鈣離子通道激活劑A23187可誘導細胞凋亡，但又可被內切酶阻斷劑玫紅三羧酸阻斷。此外，類固醇、細胞毒性物質、秋水仙堿均能誘導細胞凋亡。

1、誘導細胞凋亡的因素或因子
誘導細胞發生凋亡的因素或因子很多，有些具有普遍性作用，如各種因素（射線輻射、熱休克和紫外線照射等）導致DNA損傷，可誘導多種細胞發生凋亡。有些則具有一定的組織特異性，如糖皮質激素對淋巴細胞，轉化生長因子-β1（TGF-β1）D對肝細胞的凋亡誘導作用。在胸腺細胞孵育的一個時期，T細胞抗原受體的誘導作用可導致胸腺細胞發生凋亡。在某些靶細胞中，腫瘤壞死因子（TNF）可誘導其發生凋亡，這些靶細胞便面具有TNF受體，其TNF受體與Fas同源。許多抗腫瘤藥物可誘導腫瘤細胞發生凋亡，如多柔比星和道諾霉素、順鉑、長春新堿和秋水仙素等。

2、細胞生長因子去除后的細胞凋亡
越來越多的研究表明，最初被作為細胞增殖因子的多態生長因子中，有一些是細胞的存活因子，具有抑制細胞死亡，減少正常細胞丟失的功能，為多種類型細胞的存貨所必需。幾乎可以說，所有哺乳類動物細胞都要依賴于一種以上的生長因子來維持其存貨，這些細胞生長因子對其靶細胞的細胞凋亡抑制作用并非特異，可被各種生長因子所替代。
去除生長因子誘發凋亡反應的機制，目前尚未完全弄清楚。不過，一些研究者提出，生長因子去除后，靶細胞受體獲得的信號減少，引起信號傳代途徑的削弱，進而引發細胞許多基本功能的下調。例如，代謝速率減慢后，基因表達模式也會因此而發生改變。
Evan等人的實驗表明，生長因子去除后基因的“不平衡“表達，對這些細胞的凋亡起關鍵作用。例如，IL-3依賴的祖細胞，去除IL-3后，細胞C-myc基因表達過度，加速了凋亡的發生。
（1）生理性激活劑：
TNF家族；Fas配體；TNF。
轉化生長因子-β。
神經遞質；谷氨酸；多巴胺；去甲基-D-天冬氨酸。
生長因子缺乏。
基質的丟失；附著體。
鈣。
糖皮質激素。
（2）損傷相關誘導劑：
熱休克。
病毒感染。
細菌毒素。
癌基因myc，rel，E1A。
腫瘤抑制因子p53.
細胞溶解性T細胞。
自由基。
抗氧化劑。
營養缺乏；抗代謝物。
（3）治療相關因素：
化療藥物。順鉑；阿糖胞苷；長春新堿；甲氨蝶呤；多柔比星；爭光霉素；氨芥。
γ射線。
紫外線
（4）毒素
乙醇。
β淀粉樣。
3、細胞凋亡的抑制
對細胞凋亡具有抑制作用的因素主要有以下幾個方面。某些癌基因或細胞凋亡相關基因具有抑制細胞凋亡的作用，如bcl-2、bcl-Xl（大分子蛋白）和突變型p53等。某些病毒感染靶細胞后，為延長其宿主細胞的壽命，以利其自身的修復，則移植宿主細胞發生凋亡。如EB病毒在宿主細胞中誘導bcl-2表達，并編碼bcl-2基因 產物的同類物；腺病毒的E1B19000蛋白具有抑制細胞凋亡的作用。某些生長因子，如集落刺激因子（CSF）和神經生長因子（NGF）以及白細胞介素類(IL)具有抑制細胞凋亡的作用。正常的造血細胞因子，如粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-3和IL-6對細胞毒抗癌藥或TGF-β1所介導的細胞凋亡具有抑制作用，IL-6對野生型p53介導的細胞凋亡具有抑制作用，IL-4對用氫化可的松的介導的慢性淋巴細胞白血病細胞凋亡具有抑制作用。研究發現，在某些細胞凋亡發生過程中，存在大分子蛋白質的主動合成，某些藥物如放線菌酮和放線菌素D，可通過抑制RNA和蛋白質的合成，抑制某些因素誘導的細胞凋亡。已報道的抑制凋亡物質如下。
（1）生理抑制劑：
生長因子
細胞外基質
CD40配體
中性氨基酸
鋅
雌激素
雄激素
（2）病毒基因：
腺病毒E1B
桿狀病毒p35
牛痘病毒CrmA
桿狀病毒IAP
EB病毒BHRFI、LMA-1
非洲豬熱病毒LMW5-HL
皰疹病毒34.5
（3）藥理學因素
鈣蛋白酶抑制劑
半胱氨酸蛋白酶抑制劑
腫瘤啟動劑。PMA；苯巴比妥；α-六氯環乙烷。
易生物試劑庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

4、細胞凋亡相關基因及其調節
許多研究資料表明，細胞凋亡的激發與抑制是受遺傳因素影響的，有多種基因參與細胞凋亡的基因調控，其詳細的機制目前尚不清楚。
多種對細胞凋亡具有誘導或抑制作用的基因，其中一部分是癌基因，一部分是應用減數雜交等方法從凋亡細胞中分離的特異性細胞凋亡相關基因。
(1)誘導基因:
野生型p53
去調節C-myc
c-rel
E1A-PBX1
腺病毒E1A
華美新小桿線蟲ced-3、ced-4
APO-1Fas、CD3
TRPM-2
未成熟胸腺細胞凋亡相關基因。RP-2、RP-8
（2）抑制基因:
Bcl-2
PML-RARs
V-raf
C-fes
V-abl
H-ras
突變型p53
EB病毒LMP1
腺病毒ElL19、E314.7
單純皰疹病毒γ34.5
桿狀病毒p35
華美新小桿線蟲ced-9

三、 細胞凋亡的醫學意義
1、凋亡在發生學的作用
2、凋亡與疾病

四、細胞凋亡試驗常用的方法
（一）藥物對腫瘤細胞的抑制效應的MTT法：
用培養基將腫瘤細胞調整至2 X108個/L，在96孔板中每孔加入100ul細胞懸液于37℃、5% CO2下培養過夜。
次日每孔加入不同濃度的藥物100mg/L作為試驗組，設加完全培養基不加藥物的陰性對照，并用功能明確的藥物為陽性對照和0.5%的乙醇溶劑對照，每組均設4-6個復孔（平行孔）、37℃、5% CO2繼續培養。
培養至12h、24h、48h、實驗終止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培養4-6h后，陰性對照孔中已形成明顯的藍紫色顆粒結晶時加100ul/孔SDS-HCl終止反應，于37℃存放過夜。
用酶標儀在A570波長下測吸光度值，按下式計算抑制率
抑制率（%）=（1-試驗組平均吸光度值/陰性對照組平均吸光度值） x 100%。