miRNA與癌癥：了解它們之間的關聯

　　在腫瘤發生的經典模型中，癌癥通過慢慢積累突變、放任細胞增長而發生。許多這樣的突變影響關鍵的調控蛋白，如原癌基因和抑癌基因。不過，非編碼RNA基因的突變也同樣有害，尤其是microRNA。

　　microRNA（miRNA）是一類22個核苷酸的調控轉錄本。它們與mRNA靶點相結合，或抑制其翻譯，或誘導其降解。因此，它們也像轉錄因子一樣，影響基因表達。

　　根據Brigham婦女醫院的Sean Lawler在2014年發表的綜述，第一個將miRNA與癌癥相關聯的線索發表于2002年，研究發現慢性淋巴細胞白血病中的miR-15和miR -16缺失，導致它們的靶點BCL2上調。自那時起，人們開始研究miRNA在癌癥中的作用。

　　如今，研究人員已經鑒定出數千個miRNA，并積極研究它們的生物學，以及它們是否能作為疾病、預后或治療反應的生物標志物。各種各樣的工具也應運而生，協助研究人員更好地了解miRNA的作用。

　　模擬物和抑制劑

　　大多數的miRNA工具分成兩大類：miRNA操控和miRNA表達分析。

　　操控這一類主要是miRNA模擬物、抑制劑和表達構建體。模擬物和抑制劑是合成分子，顧名思義，模擬miRNA的表達或阻斷它們的調控能力。表達構建體讓研究人員能通過一個或多個miRNA基因的轉錄，在靶細胞上施加長期影響。

　　Dharmacon（現屬于GE Healthcare）提供模擬物和抑制劑；這些可通過轉染導入細胞。據Dharmacon研發主管Melissa Kelley介紹，研究人員可以在相同條件下、不同的孔中使用模擬物和抑制劑，尋找相反的表型，以便對結果更加自信。

　　Dharmacon也提供慢病毒表達的模擬物，稱為shMIMIC lentiviral microRNA，用于那些無法輕易轉染或需要長期活性的細胞。據Kelley介紹，shMIMIC lentiviral microRNA是短的發夾結構，在細胞中表達并被處理成成熟的miRNA，以驗證表達特定的miRNA是否能讓細胞恢復正常生長。

　　表達工具

　　與所有RNA一樣，研究人員也可以利用新一代測序（NGS）、芯片、qPCR和原位雜交等方法來定量miRNA。

　　NGS和芯片撒下了一張最大的網，特別適合探索性的研究，比如確定耐藥性的轉錄特征。這兩種方法都帶來了全基因組的覆蓋度，不過NGS是無假說的，賽默飛世爾科技的TaqMan產品經理Sara Brown如是說。“你可以鑒定之前不知道的新miRNA，但缺點在于流程和價格，以及生物信息學。”

　　Affymetrix的腫瘤產品銷售主管Guy Afseth 則表示，qPCR提供了低成本、靈敏度和通量的優勢，特別適合在大量樣品中驗證候選的miRNA，而ISH讓研究人員能夠在形態背景下定量轉錄本。

　　Affymetrix（現屬于賽默飛世爾）提供了兩方面的產品，包括GeneChip芯片，以及原位雜交檢測（ViewRNA miRNA ISH Cell Assay），能夠同時熒光定量1個miRNA和2個mRNA目標。

　　ViewRNA檢測是基于支鏈DNA雜交方案，將信號強度擴大了8000倍。據Afseth介紹，miRNA的檢測方案與其他轉錄本是相同的，不過由于miRNA很短，探針設置上就缺乏靈活性，這也意味著靈敏度和特異性可能受到影響。

　　據Affymetrix表達業務部門的銷售主管Johanne McGregor介紹，他們目前的miRNA芯片設計（4.0版，基于miRBase 20）不僅包含了miRBase數據庫中每個轉錄本的探針，也包含了其他一些短的非編碼RNA的探針，如snoRNA和scaRNA，“讓研究人員能更廣 泛地探索非編碼RNA世界”。通過該公司的MyGeneChip?定制芯片項目也可獲得定制芯片。

　　賽默飛世爾為miRNA檢測提供了兩種類型的qPCR分析。第一代的TaqMan檢測利用miRNA特異的 莖環結構引物來形成miRNA轉錄本的DNA拷貝。Brown認為，這在特異性上具有優勢，但合成的cDNA不能用于其他miRNA的分析，對于珍貴的臨 床樣本而言，這是個問題。

　　最近，這家公司推出了基于通用引物的第二代策略，擴增樣品中的所有miRNA，即使是那些還未被發現的miRNA。“你只要保存好cDNA，它可用于未來任何miRNA的研究，”Brown說。

　　如果你想要直接定量體液中的miRNA，那么Abcam的Firefly檢測適合你。據Abcam的經理Dan Pregibon介紹，Firefly依賴一系列棒狀的水凝膠微粒。每個微粒都帶有條形碼，可識別特定的miRNA；一個樣品中最多可混合70個條形碼。

　　具體過程是，將樣品與多個Firefly微粒混合，每個微粒捕獲與其互補的miRNA。那些miRNA經過 生物素化引物的擴增，再次被微粒捕獲，并標上鏈霉親和素結合的熒光基團。最后，在流式細胞儀分析微粒，以確定miRNA的種類和豐度。目前，Abcam提 供5種預制的Firefly試劑盒，也提供定制產品。

　　更好的癌癥診斷

　　所有這些工具期望的結果，當然是新的生物標志物和療法，改變癌癥診斷和治療的過程。截至2014年，至少有 20項基于miRNA的臨床試驗在進行中。不過McGregor認為，miRNA僅僅代表了一類非編碼RNA，其他種類的miRNA也發揮了關鍵的調控作 用。“lncRNA、piwiRNA、tRNA – 整個非編碼RNA的世界無疑是值得關注的，”她說。