免疫印跡（Westernblotting）實驗原理、試劑和操作步驟
(一)原理Western blot是一種在PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進行的抗原抗體反應。蛋白電泳后，將蛋白轉移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標記的二抗孵育，再進行底物顯色。由于抗原抗體反應特異性好，親合力高，Western blot檢測的靈敏度較高，尤其是采用酶促增強化學發光的方法（ECL）后，檢測的下限可達到pg水平。ECL是指酶催化底物發熒光，熒光可使X光片曝光。由于酶標記在二抗上，二抗與一抗結合，而一抗特異性結合在目的蛋白條帶處，因此顯影、定影后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。（二）試劑和材料1. PVDF膜或NC膜。2.電泳緩沖液：25 mM Tris堿、250 mM甘氨酸、0.1％SDS。3.轉移緩沖液：實驗所用的PVDF或NC膜不同，轉移緩沖液也可能不同，因此請仔細參閱PVDF或NC膜說明書。4.TBS（pH7.5）：6.05 g Tris堿（50mM）、8.76g NaCl（15......閱讀全文
免疫印跡（Western－blotting）實驗原理、試劑和操作步驟
(一)原理Western blot是一種在PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進行的抗原抗體反應。蛋白電泳后，將蛋白轉移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標記的二抗孵育，再進行底物顯色。由于抗原抗體反應特異性好，親合力高，Western blot檢測的靈敏度較高，尤其是采用
Western－免疫印跡實驗原理和操作步驟
[實驗原理]Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠
Western免疫印跡（Western－Blot）實驗原理和主要試劑
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。實驗原理與Southern或 Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電
Western－blotting電泳免疫印跡簡單原理
免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。Western Blot是檢測單一細胞蛋白表達量最好的方法；若要對表達蛋白進行細胞定位，confocal應是首選的方
Western－blotting－Protocol(試劑配方和實驗操作)
一、 試劑配方：1X TBS: Tris-base 12.11gNacl 8.775g用HCl 調pH7.4，用純水稀釋至1L5X Transfer buffer: Tris-base 15.1gGlycine 72.0gTo 1 L10X堿性磷酸酶緩沖液： 1 mol/L Tris-HCl pH
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）
Western印跡法（試劑配制和操作步驟） 這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）1
這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。儀器：高壓鍋、玻
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）2
（二）使用液單去污劑裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100?g/ml PMSF）：1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX－100 0.5ml蒸餾水至 50ml混勻后
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）3
10X麗春紅染液麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml使用時將其稀釋10倍。TBS緩沖液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTris?HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000ml
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）4
操作步驟： （一） 蛋白樣品制備 （1） 單層貼壁細胞總蛋白的提取： 1、倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。 2、每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1m
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）5
（三） SDS－PAGE電泳（1） 清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2） 灌膠與上樣1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）2、按前面方法配10％分離膠，加入
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）6
（五）免疫反應（1）將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。（2）將一抗用TBST稀釋至適當濃度（在1.5ml離心管中）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）（下）
（二）使用液單去污劑裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％SDS，1mmol/L PMSF）： 1mol/L Tris?HCl（pH8.0）2.5mlNaCl??????????????????????????????????? 0.438g10%
Western印跡法（試劑配制和操作步驟）（上）
這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。儀器：高壓鍋、電動勻
免疫印跡（Western－Blotting）實驗的樣品制備介紹
對于Western Blotting實驗而言,樣品處理是關鍵步驟之一,獲得的蛋白樣品必須均質、可溶,并解離成單個多肽亞基,且盡量減少相互間的聚集,使其最終僅依賴本身的分子量大小進行分離。當目標蛋白的含量很低時,需要選取目標蛋白含量較高的組織或細胞器(如核抽提物),或者通過免疫沉淀等方式進行富集。通常
western－blotting的原理、操作步驟及意義
一。免疫印跡法????免疫印跡法（immunoblotting?test，IBT）亦稱酶聯免疫電轉移印斑法（enzyme?linked?immunoelectrotransfer?blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測核酸的印跡方法Southen?blot相類似，亦被稱為Wester
western－blotting的原理、操作步驟及意義
一。免疫印跡法????免疫印跡法（immunoblotting?test，IBT）亦稱酶聯免疫電轉移印斑法（enzyme?linked?immunoelectrotransfer?blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測核酸的印跡方法Southen?blot相類似，亦被稱為Wester
電泳做Western免疫印跡操作步驟
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。1、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠
蛋白質印跡免疫分析（Western－Blot－Anglysis）原理和操作步驟
【基本原理】 蛋白質印跡免疫分析的過程包括蛋白質經凝膠電泳分離后，在電場作用下將凝膠上的蛋白質條帶轉移到硝酸纖維素膜上，經封閉后再用抗待檢蛋白質的抗體作為探針與之結合，經洗滌后，再將濾膜與二級試劑—放射性標記的或辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯抗免疫球蛋白抗體結合，進一步洗滌后，通過放射自顯影或原
Western－blotting（蛋白質印跡）方法原理和優化
抽濾抽濾是一種直接將蛋白質轉移到膜上的方法。利用真空使溶解的樣品濾過膜，蛋白質吸附到膜上，同時樣品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接將樣品點在膜表面使之干燥。隨后可對固定在膜上的蛋白質進行分析。點印記和狹縫印記是抽濾方法的兩種變型，用多支管裝置將樣品加到膜上成點狀或狹縫圖樣。這些方法可用于快速定性
蛋白印跡Western－Blotting抗體和樣品要求
蛋白印跡Western?Blotting抗體和樣品要求1.為保證質量，抗體最好為進口單克隆抗體；2.樣本要求：盡可能新鮮；3.?樣本量：組織樣本，質量大于100mg；細胞樣本，細胞數大于1×106；注意事項：1.市內細胞樣品可直接常溫運送，運送時在培養瓶中裝滿培養液并以封口膜封口，建議凍存后運輸。2
免疫印跡Western－bloting實驗原理
免疫印跡Western bloting 這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體（NC、PVDF膜），并以特異性抗體作為探針檢測之。抗體與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行定性、分析。
免疫印跡Western－bloting實驗原理
這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體（NC、PVDF膜），并以特異性抗體作為探針檢測之。抗體與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。這種技術的作用是對非放射性標記蛋白組成的復雜混合物中的某些特異蛋白進行定性、分析。材料（MATERIALS）：o? 試劑（REAGEN
免疫沉淀實驗原理、儀器試劑和操作步驟
（一）原理免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復合物，沉淀經洗滌后，重懸于電泳上
蛋白質印跡（Western－blotting）
印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將 DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對 RNA和蛋白
Western－Blot(免疫印跡法)實驗方法步驟
Western Blot(免疫印跡法)主要包括以下4個基本步驟：n?????樣品制備n??? ?電泳分離n??? ?蛋白的膜轉移n??? ?免疫雜交與顯色――蛋白檢測溶液和試劑n??? 1X 磷酸鹽緩沖液(PBS)n??? Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, p
western－blotting－的過程和原理
什么理論過程？就是原理唄？WesternBlot原理、顯色分類及操作步驟一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄
Southern－Blotting實驗原理、操作步驟和注意事項2
按先將水和DNA 按反應體系所需的量取至一1.5毫升離心管中，混勻，短暫離心至管底，放至100℃干浴中變性10 min，變性探針迅速置于冰浴上 5 min，按反應體系將反應混合液（dNTP，Random primer，Klenow ）加入變性DNA中，在同位素操作臺上，加入32P 標記的dN
Southern－Blotting實驗原理、操作步驟和注意事項1
對于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB染色），因為大小不等的分子呈現彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他化學發光物質），將靶DNA在凝膠上（膜上）的帶型通過特定的探針與之雜交，轉換成X光片上直觀的帶型，才能進行相關分析。另外如果需要鑒定或尋找與已知DNA同源的 DNA片段