從PEI沉淀洗脫σ32和RNA聚合酶實驗
試劑、試劑盒 緩沖液 A 含 0、0.3、0.5、0.7、0.9 和 1.1mol LNaCl 的緩沖液 A儀器、耗材 SDS-PAGE 電泳裝置聚丙烯酰胺小膠實驗步驟 材料與設備SDS-PAGE 電泳裝置聚丙烯酰胺小膠（10%)試劑緩沖液 A含 0、0.3、0.5、0.7、0.9 和 1.1mol/LNaCl 的緩沖液 A(配方，見“試劑的配制”，PP.184~189)操作程序1)PEI 懸液（見 p.153) 于離心前取 6X50ul 等分試樣。各試樣用微型離心機離心 lmin, 然后用 50ul 分別含 0、0.3、0.5、0.7、0.9 和 1.1mol/LNaCl 的緩沖液 A 重懸沉淀物。2) 充分混勻后靜置 10~15mi。再用微型離心機離心 lmin，取上清樣品，如需要，進行快速蛋白質斑點印跡試驗（見 pp.l72~173) 和 SDS-PAGE 電泳分析。結果典型的顯示 NaCl 洗脫實驗結果的 SDS 凝膠照......閱讀全文
酶測定法實驗
試劑、試劑盒 核心 RNA 聚合酶純σ32 標準品純化的 σ32 樣品核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物樣品[α-32P]UTP終止液DEAE-纖維素（DE81) 紙片P04 清洗緩沖液乙醇反應液儀器、耗材 水浴鍋實驗步驟 材料與設備核心 RNA 聚合酶 (2.3 mg/ml)純σ32 標準品 (
蛋白純化策略
（六）興風作浪的乳糖(lactose)? 晚上每天都有人做報告，我覺得讓我收獲最大的是Bill Studier的報告。本來這個報告是后來才聽到的，但是由于Burgess的模塊是唯一的涉及大腸桿菌鐘表達蛋白的，我把這一段提前來說說。Studier這老哥是Brookhaven National Labo
由非變性凝膠電泳遷移率法評估均一性實驗
試劑、試劑盒 核心 RNA 聚合酶核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物σ32 非變性膠樣品緩沖液儲存緩沖液考馬斯亮藍（CBB) 染色液脫色液儀器、耗材 非變性凝膠電泳裝置實驗步驟 材料與設備核心 RNA 聚合酶核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物，由免疫親和柱洗脫所得σ32，由 POROS 50S
由非變性凝膠電泳遷移率法評估均一性實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 核心 RNA 聚合酶 核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物 σ32 非變性膠樣品緩沖液 儲存緩沖液 考馬斯亮藍（CBB) 染色
純化RNA實驗——從培養的細胞中純化總RNA
實驗材料細胞試劑、試劑盒RNA 提取緩沖液變性液水飽和酚儀器、耗材培養皿Falcon 2063 管實驗步驟1. 取 1 個細胞已長滿的 100 ml 培養皿，吸出培養液，加 2 ml RNA 提取緩沖液，用橡膠刮棒刮下細胞。RNA 提取緩沖液：變性液，20 mlβ-巰基乙醇，0.144 ml2 mo
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基因表達實驗」中「重組痘苗病毒（VTF7-3）感染后的脂質體轉染」）的重組質粒，通過同源重組可整合到痘苗病毒中,并制備重組病毒儲液。將此病毒儲液與 vTF7-3 共同感染貼壁或懸浮細胞，在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗
兩種重組痘苗病毒共感染細胞 單病毒感染OST7-1細胞 利用VOTE系統 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 含有 pT7 控制的外源基因（「痘苗病毒系統基
從有限的細胞中提取－RNA－實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 LCM 帽子 試劑、試劑盒 乙醇 糖原 RNA 提取試劑盒 ?超純
從有限的細胞中提取－RNA－實驗
實驗材料 LCM 帽子試劑、試劑盒 乙醇 糖原RNA 提取試劑盒 超純水儀器、耗材 移液器實驗步驟 一、材料1. 緩沖液、試劑和溶液75% 乙醇 (超純水配制）糖原，5 mg/ml(Ambion，Austin，TX)StratageneRNA 提取試劑盒（200345，StratageneCloni
從有限的細胞中提取－RNA－實驗
RNA 樣品可以在-80°C 中保存 6 個月。總細胞 RNA 采用 StratageneRNA 提取試劑盒，按照說明書進行。另外，也可選用 PicoPureRNA 提取試劑盒，尤其是細胞較少時。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。實驗材料LCM 帽子試劑、試劑盒乙醇糖原R
Transfection－with－PEI
實驗概要Use PEI (Linear 25 kDa Reagent) to transfect in HEK293T cells.主要試劑PEI is polyethyleimine, a 25 kDa linear from Polysciences Inc. Make up solutio
RNA聚合酶的特點
RNA聚合酶催化RNA的合成，其與DNA聚合酶有許多相同的催化特點：①以DNA為模板；②催化核苷酸通過聚合反應合成核酸；③聚合反應是核苷酸形成3’，5’一磷酸二酯鍵的反應；④以3’→5’方向閱讀模板，5’→3’方向合成核酸；⑤按照堿基配對原則忠實轉錄模板序列。
RNA聚合酶的結構
為什么細菌的RNA聚合酶需要這么大和復雜的分子結構呢?而某些噬菌體特有的RNA聚合酶則要小得多，僅由一條多肽鏈組成。這證明RNA合成所需的機構可以遠比宿主的酶小。這種情況說明，噬菌體內的轉錄僅需一條"最小"的機構。然而這種酶只能識別噬菌體本身所有的少數幾個啟動子；它們不能識別其他啟動子。例如噬菌
RNA聚合酶的分類
通常可根據生物的類別，將RNA聚合酶分為原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特點，但在結構、組成和性質等方面又不盡相同。（1）原核生物RNA聚合酶 研究得最清楚的是大腸桿菌RNA聚合酶。該酶是由五種亞基組成的六聚體（α2ββ'ωσ）分子量約500
RNA聚合酶的作用
RNA聚合酶（RNA polymerase）的作用是轉錄RNA。有的RNA聚合酶有比較復雜的亞基結構。如大腸桿菌RNA聚合酶有四條多肽鏈，另有一個促進新RNA分子合成的σ因子，因此它的組成的是α2ββσ。這種結構稱為全酶（holoenzyme），除去了σ因子的酶稱為核心酶。噬菌體RNA聚合酶則沒
RNA聚合酶的類別
通常可根據生物的類別，將RNA聚合酶分為原核生物RNA聚合酶、真核生物RNA聚合酶。原核生物和真核生物的RNA聚合酶有共同特點，但在結構、組成和性質等方面又不盡相同。（1）原核生物RNA聚合酶 研究得最清楚的是大腸桿菌RNA聚合酶。該酶是由五種亞基組成的六聚體（α2ββ'ωσ）分子量約500
由非變性凝膠電泳遷移率法評估均一性實驗
當蛋白質在保持其天然構型不變的條件下進行電泳時，其遷移率可以作為它的均一性的一種量度。由于遷移率是電荷和形狀兩者的函數，因此可以預期，能將單體、二聚體等形式彼此分開。也有可能因異構體形狀的差異而用非變性凝膠電泳把蛋白質的構象異構體（conformational isomer) 分開。本實驗來源于蛋白
熒光RNA隨機引物觸發的聚合酶鏈反應實驗
實驗步驟 ##一、 從組織和培養細胞中分離RNA1.TRIzol試 劑（Invitrogen)。該試劑含有苯酚和硫氰酸鹽化合物，操作時應穿實驗服，戴手套，存放于 4°C 。2.氯仿。3.異丙醇。4.乙醇。5.焦炭酸二乙酯（DEPC) 處理的水
熒光RNA隨機引物觸發的聚合酶鏈反應實驗
差異顯示聚合酶鏈反應（PCR) 可促進在諸多物種中與污染暴露相關的新分子標志物的鑒定。至今，已有多種差異顯示方法被詳細描述。這里，我們描述了一種改良的RNA 隨機引物觸發的 PCR 方 法（RNAarbitrarily primed PCR， RAP-PCR) , 主要涉及通過 羅 丹 明（rhod
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗
實驗材料 載體試劑、試劑盒 氨芐青霉素卡那霉素pGP裂解緩沖液儀器、耗材 培養箱分光光度計離心機實驗步驟 1. ?將含有待表達基因的片段亞克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，轉化一種標準大腸桿菌菌株，此菌株不應帶有可指導T7 RNA聚合酶合成的質粒。轉化物涂布于氨芐青霉素平皿，于37℃溫育培養
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（二）
單病毒感染OST7-1細胞實驗方法原理OST7-1 細胞來源于鼠 L929 細胞，能在細胞質中持續表達噬菌體 T7 RNA 聚合酶，因此，應用此細胞系無需用 vTF7-3 感染細胞。實驗材料貼壁培養的單層 OST7-1 細胞含有 pT7 控制的外源基因的重組病毒儲液試劑、試劑盒完全 MEM-2.5
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（三）
實驗方法原理VOTE是最近發展的痘苗病毒/T7 RNA聚合酶混合表達系統，將外源基因克隆到質粒 pVOTE. 1或 pVOTE. 2 中，通過同源重組將其整合到痘苗病毒 vT7lacOI 基因組中，制備重組病毒儲液。在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）存在的條件下，用重組病毒感染細胞，外源基因
T7RNA聚合酶系統基因表達實驗（一）
本節介紹依賴于在哺乳動物細胞質合成噬菌體T7 RNA聚合酶的瞬時細胞質表達系統。首先，將感興趣的基因插入質粒中，使其位于T7 RNA聚合酶啟動子（PT7）的控制下。在培養過程中，外源基因被高效的 T7 RNA聚合酶轉錄。這種轉染方案適用于分析的目的，因為不需要構建新的重組病毒，所以比較簡單。對于大規
T7－RNA聚合酶/啟動子表達實驗
基本方案 備選方案 備選方案2 ? ? ? ? ? ? 實驗材料 載體 試劑、
利用－Trizol－從植物組織中制備－RNA－實驗
? ? ? ? ? ? 實驗材料 植物組織 試劑、試劑盒 Trizol 氯仿 異丙醇 乙醇
利用－Trizol－從植物組織中制備－RNA－實驗
下述方案是經修改過的 Trizol 方案，用于從植物組織中分離 RNA，其中增加了一個高鹽異丙酵沉淀步驟，以選擇性地沉淀 RNA，而將多聚糖和蛋白多糖留在溶液里。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。實驗材料植物組織試劑、試劑盒Trizol氯仿異丙醇乙醇DEPC處理過的水液態
利用－Trizol－從植物組織中制備－RNA－實驗
實驗材料 植物組織試劑、試劑盒 Trizol氯仿異丙醇乙醇DEPC處理過的水液態N2NaCl檸檬酸鈉儀器、耗材 轉子-定子均化器研缽和杵圓錐形管實驗步驟 一、材料1. 緩沖液、溶液和試劑Trizol(Invitrogen)氯仿異丙醇乙醇，70%，用焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的水配制DEPC 處
RNA聚合酶的催化特點
RNA聚合酶催化RNA的合成，其與DNA聚合酶有許多相同的催化特點：①以DNA為模板；②催化核苷酸通過聚合反應合成核酸；③聚合反應是核苷酸形成3’，5’一磷酸二酯鍵的反應；④以3’→5’方向閱讀模板，5’→3’方向合成核酸；⑤按照堿基配對原則忠實轉錄模板序列。
RNA聚合酶的參與過程
該酶需要四種核糖核苷酸三磷酸（NTP：ATP、GTP、CTP、UTP）作為RNA聚合酶的底物，DNA為模板，二價金屬離子Mg2+、Mn2+是該酶的必需輔因子。其催化的反應表示為：（NMP）n+NTP→（NMP）n+1+PPi。RNA鏈的合成方向也是5’→3'，第一個核苷酸帶有3個磷酸基。其后
RNA聚合酶的功能特點
RNA聚合酶（RNA polymerase）是以一條DNA鏈或RNA為模板，三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶，因為在細胞內與基因DNA的遺傳信息轉錄為RNA有關，所以也稱轉錄酶。