WesternBlot常見問題總結
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與或標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。 關于Western Blot技術，我們實驗室憑著幾年來的豐富經驗，總結出以下幾點建議： 1.抗體的選擇 對于國內的大多數實驗室來講，做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，買進口抗體捉襟見肘，買國產抗體得需要大無畏的勇氣。在我們實驗室western blot實驗歷程里，我們用過進口抗體，進口抗體國內分裝包裝，國產抗體，質量良莠不齊。 進口抗體一般不會出現閃失：Abcam品種全，質量過硬，但價高；Sigma的價最貴......閱讀全文
Western－Blot常見問題總結
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與或標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電
western－blot失敗經驗總結1
我做了很久的WB，最大的一個難點感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loadi
western－blot實驗經驗總結（二）
問題4：有陽性條帶，但條帶比較弱（1）抗體染色不充分增加抗體濃度，延長孵育時間。（2）酶活性降低直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內、有活性的酶聯物。（3）標本中靶蛋白含量太低增加標本上樣量。（4）洗膜過度縮短洗滌時間。（5）HRP抑制劑所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。
western－blot實驗經驗總結（一）
做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，其實發現WB想要做好并不難，總結了WB實驗中可能會遇到的問題，分析了可能的原因及對應的解決方案，希望能成為你實驗成功的基石。?問題1：轉膜不充分(1)膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜。(2)靶蛋白分子量小于10 000選
western－blot失敗經驗總結2
我就跑膠和轉膜談一點兒自己的體會1、跑膠 電泳Buffer重復利用的時候要注意，不能混濁，有時候能用個3－4次，有時候第二次都不行了，事先前預電泳一下，看看氣泡的均勻度；Buffer一定要淹過梳子孔，否則就會發現今天的蛋白不會跑；跑的時候先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，不要追求速度，慢慢跑
western－blot常見問題及解答
常見問題及解答： 1 、兩快玻璃板之間灌膠 , 膠為什么總是不平 ? 1)你的玻璃洗干凈沒有？應該要洗得非常干凈！ 2)過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對較多，凝膠凝固過快也會膠不平，最多按照分子克隆加倍 3)加完試劑以后沒有很好的搖勻，導致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快
CST抗體－Western－Blot常見問題與解答
1.Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或無特異性蛋白帶） 2.Problem：信號弱（1-30秒的曝光后檢測不到信號） 3.Problem：無著色 4.Problem：著色太淺 5.Problem：著色太深 6.
免疫印跡（Western－Blot）常見問題及建議
? ? ? ? ? 問題? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 可能原因? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 建議電泳條帶成笑臉狀膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統溫度偏高減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進行電泳電泳條帶成皺眉狀可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃
western－blot技術要點和WB常見問題分析
WB過程中常見的問題及可能原因分析
western－blot原理
Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢
Western－Blot－Protocol
一、提取抗原蛋白將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min,?吸取上清至新管中,?加入750μl異丙醇,?混勻,?靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min,?棄上清,?加入1ml 0.3mol/L
Western－Blot－(AP)
主要試劑1. Membrane Blocking buffer:5% Milk ? 0.05% of Tween 20 PBS2. antibody dilution buffer: PBS 0.05% of Tween20 1.0% Milk(or BSA)?3. washing buffer:?
Western－Blot詳解
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。 本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術: 一、原理 二、分類
Western－Blot實驗技術詳解和常見問題解答
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被
Western－Blot實驗（一）
大家都知道Western Blot時間周期較長，大致可以分為忙碌的第一天，和心痛的第二天，像極了愛情。人生若只如初見，何事秋風悲畫扇。經歷轉瞬即逝的新手曙光后，便進入漫長的黑夜。第一天，從最一步的配膠，到最后一步的孵育膜都極細心像極了愛情的萌芽期，需要精心的呵護。第二天經過繁瑣的洗膜，孵二抗，洗膜，
Western－Blot詳解－原理
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。?原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢
Western－Blot實驗（二）
小巧的體格，卻一應俱全，可以靈活控制多種應用程序，包括化學發光，熒光，DNA/蛋白膠。可以滿足對實驗室各種樣品成像的要求。是目前市面上唯一的一款既可進行Cy3, Cy5, Cy2 多色熒光LED成像，又可在700和800nm處進行近紅外激光定量熒光western 成像系統。這達到對成像最完美
Western－Blot詳解（六）
GGG.我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進
Western－Blot詳解（一）
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下Western Blot技術:一、原理二、分類i.放射自顯影ii.底物化學
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為Southe
Western－Blot詳解（三）
3.抗體T.做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。U.同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜，
Western－Blot詳解（五）
CCC.Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次發光protocol:1.stripping buffer
Western－Blot詳解（二）
11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標記的第二
Western－Blot實驗步驟
實驗步驟： 1.分別配制 5%濃縮膠和12%分離膠 12%分離膠10mL 5%積層膠6mL H2O 3.3mL H2O 4.20mL 30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris
Western－Blot詳解（七）
TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％
western－blot試驗心得
前兩天做了一個western blot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！1 本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個
Western－Blot－with－Platelet－Protein
OUTLINEWestern blot is a wide used technique to identify a target protein/s for the certain antibody.PROTOCOLPrepare platelets.Lyse washed platelets (
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術
Western－Blot詳解（四）
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。5.Marker的相關疑問MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，