1、NSUN2影響m5C在HEK293細胞中整體分布情況
NSUN2被報道是RNA甲基轉移酶，能使tRNAs和mRNA發生m5C甲基化修飾。為了探究NSUN2對HEK293細胞mRNA m5C甲基化修飾的影響。作者利用CRISP/Cas9技術敲減NSUN2（NSUN2-/-HEK293細胞）后進行RNA-BisSeq。經過生信分析，發現在HEK293細胞有12442個m5C位點，在NSUN2-/-HEK293細胞中有3270個m5C位點，在注釋mRNA中分別有1142個和376個m5C甲基化位點（A）。且NSUN2下調能夠降低m5C甲基化程度（B）和部分染色體上m5C位點數目（C）。但是，NSUN2下調并不改變m5C位點的motif偏好性，HEK293細胞中，CG含有22%，CHG含有33%，CHH含有45%；NSUN2-/-HEK293細胞中，CG含有24%，CHG含有33%，CHH含有43%（C、D）。這些數據顯示，NSUN2能夠影響m5C位點在HEK293細胞中的分布。
2、NSUN2調節的差異m5C mRNA的功能預測
為了進一步探究NSUN2如何影響HEK293細胞功能。作者對發生差異m5C mRNA（DMGs ）進行了GO和KEGG注釋分析。GO注釋顯示這些DMGs與轉錄起始、mRNA分解代謝過程、RNA剪接、RNA輸出、mRNA穩定性調節及基因表達均有顯著相關（A）。KEGG分析顯示與核糖體、剪接體、RNA運輸和凋亡通路以及PI3K-Akt信號通路顯著相關（B）。這些結果說明，NSUN2調節的m5C甲基化可能通過RNA的合成和翻譯，進一步影響基因表達水平。
3、NSUN2對mRNA的表達水平的影響
為了探究NSUN2調節的m5C RNA甲基化對mRNA表達水平的影響，作者對NSUN2-/-HEK293和HEK293細胞進行了RNA-seq。結果顯示有790個差異表達的基因（DEGs），其中467 個上調，323 個下調（A）。為了進一步探究NSUN2對這些DEGs功能的影響，作者對DEGs進行了GO和KEGG注釋分析。GO注釋顯示這些DMGs與細胞黏附、神經系統發育、細胞表面受體信號傳導、細胞分化、細胞增殖均有顯著相關（B）。
4、NSUN2能夠調節HEK293細胞的增殖和遷移
有研究報道NSUN2能夠促進一些癌癥細胞的增殖和遷移。為了進一步探究，NSUN2對HEK293細胞增殖和遷移的影響，作者進行MTT、克隆形成和劃痕實驗。結果顯示下調NSUN2能夠抑制HEK293的增殖（A，B）和遷移（C）。
5、NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293細胞增殖和遷移能力
為了證明NSUN2確實影響HEK293細胞的功能，作者在NSUN2-/-HEK293細胞中過表達NSUN2后（A），進行MTT和劃痕實驗。結果展示NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293細胞增殖和遷移（B-C）。
6、與細胞增殖和遷移相關的差異基因的表達譜
以上結果都證明NSUN2與HEK293細胞的增殖和遷移相關。為了探究與其相關的基因，作者通過GO注釋，發現了86個 DEGs與增殖相關（D）、57個 DEGs與遷移相關（B）、32個 DEGs與增殖和遷移相關（C）。
7、PCR驗證與增殖和遷移相關的差異表達的基因
為了探究測序的可靠性，作者通過PCR探究了7個與增殖和遷移的關鍵基因（FN1, CD44, GRB2, TGFB1,ITGA3, THBS1的表達，跟測序結果一致（A）。同時，發現NSUN2能夠恢復NSUN2-/-HEK293中CD44, GRB2的表達（B）。這說明測序數據是可靠和可信的。
總結
RNA甲基化依然是當下生命研究競相追逐的科研熱點，本文作者的研究思路跟m6A的典型研究模式異曲同工。作者從m5C 甲基化酶（NSUN2）出發，并對其進行干預后，進行m5C RNA甲基化測序和RNA-seq，然后將表觀轉錄組學和轉錄組學進行聯合分析，探究該酶調控的靶基因，從而探究NSUN2通過影響基因表達參與HEK293細胞功能的調控。這種方法對于探究酶調控的靶基因，簡單快捷高效，且多組學聯合分析，文章內容豐富，可呈現的信息多樣，是目前通過酶研究甲基化的一大利器，受到眾多科研工作者的追捧。