PCR擴增產物的克隆技術1

利用各種PCR技術擴增特異DNA是獲得目的基因和特異探針的一種最有效、最簡便的方法。但PCR擴增出的片斷如不經進一步克窿是無法變成可利用基因，因此PCR擴增產物的克窿技術是DNA重組技術中的一個最重要部分，該技術是目前分子生物學實驗中最重點內容，要綜合前面實驗中所介紹的各種技術，起著承上啟下的作用。PCR產物的克隆一般要經過PCR產物的純化、產物與載體的酶切、脫磷及連接、轉化、篩選等幾個步驟實現。PCR產物與載體的連接方式有實驗八中提到的溶液連接和膠內連接，可粘連、平連、粘平連及與T－載體的單位點配對連接（見圖9－1）。

PCR產物 PCR產物 PCR產物 PCR產物 PCR產物

（上下游引物中各帶 （上下游引物中僅有（上下游引物 （PCR產物與載體

一種特異酶切位點）一種特異酶切位點） 中無酶切位點） 均有兩個酶切位點

但只有一個是相同的）

PCR產物 純化回收

PCR產物及載體 PCR產物單酶切 PCR產物Klenow酶補平PCR產物與載體 T－載體

雙酶切，載體脫磷 載體雙酶切、脫磷 載體用平末端酶切割 雙酶切載體脫磷 單堿基

粘連 粘連, Klenow酶補平載體脫磷后平連 粘連 Klenow補平 粘連

后平連 或加接頭粘連酶補平 平連

1：PCR產物克窿方式示意

粘連時載體與外源DNA的比例1：3比較合適，而平連時可達到1：10

在這些方法中，T－載體技術比較簡便有效的，尤其對于一些多克隆位點的可選擇內切酶種類稀少的表達載體該技術特別適用。該方法具有不需對引物進行特殊酶切位點的修飾，即能直接進行PCR產物的克隆，并具有克隆效率高的特點。通用載體的T-載體有商品出售，一些特殊載體的T－載體可自己制備。T-載體均是通過載體是通過用EcoRⅤ或SmaI等平末端酶將相關載體切割出平端,然后再在其兩個3`端加上T而構成的。這些存在于插入位點的突出的3`末端可防止載體的自身環化,并為PCR產物提供堿基配對區（因PCR擴增產物的3`末端為非特異性的A堿基）而有效地提高了PCR擴增片斷的克隆效率。

本實驗中用pGEMR-T載體為材料，來讓學員學習T－載體克窿技術。PGEM－T載體來自于PGEM系統載體，這類載體中中含有T7和SP6RNA聚合酶的啟動子系列,該系列側翼為一多克隆位點區,該區有β-半乳糖苷酶的α-肽端的編碼區。β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區的插入失活,能使重組子在指示平板上通過顏色反應加以檢測。此兩個載體的多克隆位點區含有多種內切酶位點,此很容易來構建嵌套缺失位點。pGEMR-T Easy載體系統的多克隆位點兩側都存在EcoRⅠ、BstZⅠ、NotⅠ,因此該載體可通過這三類酶進行單酶切構而建重組片斷; 而pGEMR-T載體系統的多克隆區兩側都有BstZⅠ酶切序列,因此用此酶進行單酶切操作,即可釋放出可插入位點。除了單酶切外,這兩類載體都可通過雙酶切操作來形成插入位點。pGEMR-T及pGEMR-T Easy載體系統中都有嗜菌體f1的復制起始區,借此可以合成單鏈DNA。并可用雙重反向啟動子(T7,SP6)進行體外轉錄。在pGEMR-T系列載體系統中,外源片斷的克隆將打破載體中的β半乳糖苷酶的編碼序列,因此重組子可在指示平板上用顏色反應加以篩選。將外源片斷克隆到pGEMR-T載體中,然后再轉入感受態細胞,這樣在指示平板上藍白斑的比例將下降,在通常情況小,外源片斷的插入將產生白斑,但在某些情況小,含重組子的載體也能形成藍斑,這主要是插入片斷長度(包括3`A突出末端)為3`核苷酸的倍數,且插入位點在lacZ基因的閱讀框內,并插入片斷不含終止密碼子。這樣就可能不破壞閱讀框而翻譯出含β半乳糖苷酶N端多肽片斷的融合蛋白,與宿主菌的C端片斷發生α-互補而形成藍斑。有文獻報道當重組的外源DNA片斷接近2Kb時,其可能會克隆到閱讀框,并產生藍斑。即使實驗中預設擴增片斷并非3`核苷酸倍數,但擴增過程可能會導致核苷酸突變(缺失突變或點突變),這種片斷與pGEMR-T系列載體重組后,再轉化到感受態細胞中后,即有可能產生藍斑。這點已有文獻報道，因此在篩選重組菌斑時要特別注意。