4．我們上面介紹的只是一種基本的PCR反應條件，對于具體的每一種PCR反應，反應條件差異很大，需要根據情況調整。
（1）時間：上面介紹的時間適用于在0.2 ml薄壁管進行PCR反應，其反應體積為50 μl，熱循環儀為Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR儀（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的設備和反應體積發生改變，則時間和溫度均需要調整。
每一步的時間應從反應混合物達到所需要的溫度后開始計算。一般來說，由混合液原溫度達到所要求溫度的時間需要30-60秒。溫度滯后時間的長短取決于以下幾個因素，包括反應管的類型、反應混合物的體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩個連續步驟間的溫度差。因此調節溫育時間以補償這一滯后時間是非常重要的。
兩寡核苷酸引物之間的距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長。上面給出的反應時間是按1000個核苷酸的靶序列擬定的。
（2）溫度：選擇寡核苷酸引物到DNA模板的退火溫度是一個折衷的方案。如果降低退火溫度則擴增效率提高，但引物與模板間的錯配現象又可明顯增加。若將溫度提高，則擴增反應的特異性增加，但總的反應效率則會下降。因此理想的辦法是設置一系列對照反應，以確定某一特定擴增反應的最適退火溫度。
（3）循環次數：擴增反應的循環數取決于反應混合液中靶DNA的濃度，若將哺乳動物基因組中單拷貝基因擴增至能為瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳所見，至少需要25個循環。
靶序列的指數式的擴增不是一個無限制的過程。在正常反應條件下，經過25-30個循環擴增（即擴增約106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成為制約反應進行的因素。如需進一步擴增，應將所得的DNA樣品稀釋1000至10000倍后，再作為模板進行新的PCR。
（4）緩沖液：當標準緩沖液于72oC溫育時，反應體系的pH值將下降1個多單位，致使緩沖液的pH值接近7.2。二價陽離子的存在至關緊要，鎂離子優于錳離子，而鈣離子則無效。鎂離子的最佳作用濃度相當低(1.5 mM)，因此重要的是，所制備的模板DNA中不應含有高濃度的螯合劑，如EDTA；也不應含有高濃度的帶負電荷離子基團，如磷酸根。所以，用作模板的DNA應溶于10 mM Tris-Cl (pH 7.6), 0.1 mM EDTA (pH 8.0)中。
在較為廣泛的范圍內，這種標準緩沖液對于各種模板的寡核苷酸引物都能行之有效，當它并非對于模板與引物的任何一種特定組合都是最佳的。因此，應當將以上所列條件作為出發點進行修飾和改良。每當首次使用靶序列和引物的一種新組合時，或者，dNTPs或引物的濃度變化時，特別要將Mg2+濃度調至最佳。dNTPs是反應中磷酸根的主要來源，其濃度的任何變化都將影響到Mg2+的有效濃度。我們建議設置一組反應，其中每一反應的Tris-Cl (10 mM)和氯化鉀 (50 mM)濃度相同，而氯化鎂濃度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反應結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色來比較各擴增產物的量。
PCR可在熱循環儀（即PCR儀）中自動進行，以使反應各循環標準化。
5. 一般來說，如第一次用新的模板DNA、新的引物或者新制備的耐熱DNA聚合酶作PCR，擴增將不如預期理想。PCR反應條件需仔細調整，以抑制非特異擴增和（或）提高目標DNA的產量。
6. 一個成功的PCR擴增反應，可出現一個顯而易見的與預期大小一樣長度的DNA片段，此可通過DNA序列分析、Southern 雜交和或限制性圖譜分析確定。