實時熒光定量PCR實驗體系的設計與優化

時熒光定量PCR以其精確、快速、方便，越來越多的應用在科研、臨床及檢驗檢疫的各個領域。但是定量PCR是對精確性要求很高的實驗，不僅要求在實驗前有比較完整的實驗設計方案，而且實驗的條件對實驗結果的影響也非常大。這些都是很多老師與學生非常關心的問題，下面分別從這兩個方面來對定量PCR實驗做一些闡述。

定量PCR實驗步驟(以mRNA為例)：

1.設計實驗方案：例如對樣品、實驗組和對照組的一個實驗流程設計

2.引物和探針的設計和合成

3.抽提RNA，測定提取的RNA的濃度

4.反轉錄PCR

5.定量PCR

6.數據分析

在進行定量PCR實驗的過程中，PCR的擴增效率是一個非常重要的影響因素，因為定量PCR原理的理論方程是基于擴增效率最大值1，因此高的擴增效率能保證定量PCR實驗的精確性及重復性，影響PCR擴增效率主要有以下幾個方面：1，擴增子的長度;2，擴增子的GC含量;3，擴增子、引物和探針的二級結構;4，PCR反應各組分的濃度;5，RNA或者cDNA的純度。

進行定量PCR實驗時，必須設計好引物和探針，除了能獲得高的擴增效率外，對PCR擴增的特異性、消除DNA的擴增及提高擴增的靈敏度都有很大的影響。下圖就是使用不同的引物和探針對18SRNA進行定量PCR的熒光曲線圖(反應條件和模板都相同)。

引物設計原則：

1.上下游引物要保守為了能夠擴增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200片段進行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守。

2.上下游引物的長度一般為18-30bp之間，且Tm值在58-62℃之間，上下游引物的Tm值相差最好不超過2℃。

3.確保引物中GC含量在30-80%。應避免引物中多個重復的堿基出現，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現。引物的3’端最好不為G或/和C。引物3’端的5個堿基不應出現2個G或/和C。

4.避免引物內出現反向重復序列形成發夾二級結構，同時也應避免引物間配對形成引物二聚體。5.跨外顯子設計引物，用于區別或消除DNA的擴增。

探針設計的基本原則：

1. 保守：探針要絕對的保守，有時分型就僅僅依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。

2. Taqman探針的長度最好在25-32bp之間，且Tm值在68-72℃之間，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，這樣可保證探針在退火時先于引物與目的片段結合。

3. 確保探針中GC含量在30-80%。

4. 避免探針中多個重復的堿基出現，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基

5. 探針的5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時， 也可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。

6. Taqman探針應靠近上游引物，即Taqman探針應靠近與其在同一條鏈上的 上游引物。兩者的距離最好是探針的5’端離上游引物的3’有一個堿基。

7. 避免探針與引物之間形成二級結構。

8. 對于多重定量PCR，例如SNP分型檢測時，SNP位點應設計在探針的中間位置，并且兩種探針的Tm值應相近。

實時定量PCR體系的優化

1.基本參數的優化：

1)MgCl2的濃度：在PCR反應中，MgCl2的濃度對酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossingpoint)值(指PCR達到指數擴增期時，產生一定的熒光高于背景并為儀器所識別時的循環數)，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的濃度選擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2-5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT-PCR而言，則應選擇的濃度為4-8mM。

2)模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度(高和中、低濃度)來進行實驗。一般而言，使Cp位于15-30個循環比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經驗上是SYBRGreenI探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。

2.使用SYBRGreenI測定DNA時的條件優化：

1)MgCl2的濃度：大多數引物-模板對其的要求是2-4mM。

2)模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。DNA在50ng-5pg之間選擇，質粒DNA在106拷貝數左右。

3)引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，若濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對于大多數PCR反應，0.3uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.1-1.0uM之間進行選擇，直至達到滿意的結果。

4)退火溫度：首次實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5℃，然后在1-2℃內進行選擇。一般的，退火溫度要根據經驗來確定，這個經驗值往往會同計算得到的Tm值有一定的差距。

3.用SYBRGreenI進行一步法RT-PCR的條件優化：

1)MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4-8mM之間選擇。

2)模板的濃度：RT-PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternativeRNA作為載體進行測定。

3)對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。

4.雜交探針測定DNA

1)MgCl2的濃度：在2-4mM的基礎上加0.5-1.0mM，但是不要超過2.0mM。

2)雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4uM。

3)對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。

4)其它的條件同SYBRGreenI。

5.用雜交探針進行實時定量RT-PCR：

1)MgCl2的濃度：在4-8mM之間進行選擇。

2)雜交探針的濃度：初實驗用0.2uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。

3)模板濃度設置：優化的擴增須進行一系列稀釋度的實驗，在條件有困難的情況下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小(小于10ng/ul)，則可加入MS2或alternativeRNA作為載體。

4)對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。

6.關于雜交探針的評價：在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針-引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物-探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，導致反應的效率下降。探針其本身能同目的基因相結合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發延伸反應，為了防止發生這種現象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產生目的基因的副產品，從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端完全磷酸化。