PCR（聚合酶鏈式反應）
【原理】
PCR（polymerase chain reaction）用于在體外將微量的目標DNA大量擴增，以便進行分析。反應體系：①樣品DNA；②引物（primer），是人工合成的一對寡核苷酸鏈（約15-20個核苷酸），用于擴增夾在雙引物與模板DNA互補區之間的區域；③4種dNTP；④Tag DNA聚合酶，是從一種嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）中分離出來的。此酶最適作用溫度為75～80℃，但短時間在95℃下不失活。⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反應過程：①變性：將反應液置于PCR儀中，提高溫度（約90-95℃）使DNA雙鏈解離；②復性：降溫（約60℃左右）退火，使引物與模板結合；③延伸：升溫度至70-75℃，在引物的引導下合成模板單鏈的互補鏈，從而形成DNA雙鏈片段；④重復上述“變性——復性——延伸”的過程。最初幾次循環中形成的長鏈DNA較多，但隨著反應的進行，長鏈DNA以算術級數增加，而夾在兩個引物之間的目標DNA以指數級數增長，經大約20—30次循環后，擴增產物中主要是目標DNA。
【材料】
1. 試劑和溶液
（1）10 × PCR緩沖液
500 mM 氯化鉀
100 mM Tris-Cl (室溫時pH 8.3)
15 mM 氯化鎂
（2）10 mM脫氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液－含有所有四種dNTPs(pH 8.0)
（3）耐熱的DNA 聚合酶：
① Taq DNA 聚合酶是從表達克隆嗜熱水生菌的DNA 聚合酶基因的大腸桿菌提純而來。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量約為94 千道爾頓的多肽組成。Taq DNA聚合酶對熱穩定，能在較高的溫度下利用引物將單鏈模板合成為DNA。 催化一典型的PCR所需酶量約為2單位。加酶量過多則有可能導致非靶序列的擴增。
Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR過程中核苷酸摻入錯誤率可達每循環2 × 10-4個核苷酸，約比使用大腸桿菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段時高4倍。對于一個30輪循環的擴增反應來說，這一摻入錯誤率將導致0.25％的總錯誤頻率。這一頻率似隨和濃度的升高而增大。這些錯誤的摻入可以發生在擴增產物的任何位置，既有顛換也有轉換（但并無長的缺失、嵌合或插入）。
單位的定義：一單位是指于74oC將l0 nmol的脫氧核糖核苷酸30分鐘內摻入到酸性沉淀的物質中。其實驗條件是：25 mM TAPS (pH9.3), 50 mM 氯化鉀, 2 mM 氯化鎂, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鮭魚精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP。
② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)兩種菌中耐熱DNA聚合酶的混合。這種混合酶特別具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的雙重活性。當按推薦量使用時，此酶可提高保真度及長鏈PCR的產量。
常規PCR擴增靶DNA序列一般在5 kb以內。而rTth DNA 聚合酶可從人類基因組DNA中擴增至19.6 kb的β－球蛋白基因群和噬菌體λDNA的42 kb的片段。
（4）瓊脂糖凝膠
（5）10 μM的上游和下游引物
（6）DNA模板
（7）對照DNA（含有靶序列的DNA）
（8）DNA長度標準參照物
2. 設備
（1）0.2 ml PCR擴增管
（2）可預先設定擴增方案的溫度循環器(PCR儀)