PCR基因擴增

發布時間：2019-04-23 18:39 原文鏈接： PCR基因擴增

實驗概要

PCR擴增目標DNA片段。

實驗原理

多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟構成。
1. 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備； 2. 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合； 3. 引物的延伸：DNA模板－引物結合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性、退火、延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴增的目的基因擴增放大幾百萬倍。典型的PCR反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖液、dNTP、MgCl₂、兩個合成的DNA引物、耐熱 Taq聚合酶。
除了典型的PCR外，人們還根據各種用途設計了各種不同的PCR。如： RT-PCR，即在mRNA反轉錄之后進行的PCR。反向PCR，常規PCR允許擴增兩引物之間的DNA區段，而反向PCR則可以對靶DNA區段之外的兩側未知的DNA序列進行擴增。不對稱PCR，常規PCR使用的引物濃度相同，而不對稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍。在最初20各循環中，主要產物是雙鏈DNA。當低濃度引物被耗盡后，高濃度引物引導的PCR就會產生大量單鏈DNA，單鏈DNA可用于序列測定。

主要試劑

1. DNA模板（1ng/μL）（質粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）
圖1 pGEX-4T-1質粒示意圖
2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa) 3. 10×PCR緩沖液(TaKaRa) 4. 25mmol/L MgCl₂(TaKaRa) 5. 引物1、引物2（5pmol/μL）引物序列如下：引物1：5’-CGGAATTCATGGACGGTCAGA-3’ 引物2：5’-GCGTCGACTCATTCAGATTTGCG-3’ 6. Taq DNA聚合酶(TaKaRa) 7. 瓊指糖 8. 溴化乙錠（1%EB，終濃度0.5μg/mL） 9. DNA marker 2000(TaKaRa)

主要設備

1. PCR熱循環儀 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統 3. UVP凝膠成像系統 4. 移液槍（配套槍頭）
5. PCR管

實驗步驟

1. PCR反應體系的配制，即在薄壁管內配制25μL反應體系，按下表準確加入各反應物。

反應物	體積/μL
10×PCR緩沖液	2.5
25mmol/L MgCl₂	1.5
2.5mmol/LdNTP	2.0
引物1	2.0
引物2	2.0
Taq DNA聚合酶	0.2
模板DNA(1ng/μL)	2.0
加ddH₂O至25μL	12.8

2. PCR反應條件的設置，即在PCR熱循環儀上設置程序，按程序設置的條件進行擴增。（1）94℃預變性5min；（2）94℃變性40s; （3）55℃退火50s；（4）72℃延伸50s；（5）重復步驟（2）～（4）30次；（6）72℃延伸8min；（7）12℃ for ever。
3. 1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結果（此步驟與PCR擴增產物的割膠純化一起進行。）

注意事項

PCR的每一個成份是如何影響PCR反應的： 1. 耐熱DNA聚合酶 2. PCR反應的緩沖液 3. PCR引物
4. dNTP 5. 模板DNA 6. 溫度循環參數

參見附件：PCR的注意事項

附件 (共2個附件,占124KB)

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