PCR產物的TA克隆

實驗概要

本實驗介紹了DNA回收和連接的基本原理，PCR產物的T-vector克隆。

實驗原理

1. DNA片段回收方法：DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產物插入到質粒載體的多克隆位點，可用于PCR產物的克隆和測序。

主要試劑

1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖(Agarose)
4. 6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
5. 溴化乙錠(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲于室溫即可。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒(Omega公司)

主要設備

1. 水平式電泳裝置

2. 電泳儀

3. 臺式高速離心機

4. 恒溫水浴鍋

5. 微量移液槍

6. 微波爐或電爐

7. 紫外透射儀

8. 凝膠成像系統或其它照相設備

實驗步驟

1. 膠回收試劑盒回收PCR產物(以Omega公司 Gel Extraction Kit為例)

   1) 當目的片段DNA完全分離時，轉移凝膠至紫外燈上盡可能快地切下目的片段。
    2)  凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積(假設其密度為1g/ml)。加入等體積的Binding  Buffer(XP2)，于55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化，每2-3  min振蕩混合物。(在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-Binding  buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5  M，pH為5.2的醋酸鈉，以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。)
   3) 取一個干凈的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(已備好)。
   4) 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。
    5)  如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉移700ul至柱子中，余下的可繼續重復第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind  DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大，則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
   6) 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中，室溫下， 10,000 x g下離心1min。
    7) 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash  buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。(濃縮的SPW Wash  Buffer在使用之前必須按標簽的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩沖液在使用之前是置于冰箱中的，須將其拿出置于室溫下)。
   8) 重復用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
   9) 棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘余的液體。
    10) 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl(具體取決于預期的終產物濃度)的Elution  Buffer(或TE緩沖液)到柱基質上，室溫放置1min,  13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低。

2. 連接反應(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例)

   1) 在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
   dH₂Oup to 5 μl
   2) 加入5 μl(等量)的 Solution I。
   3) 16℃反應30分鐘。(2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時，連接反應時間請延長至數小時)。
   4) 全量(10 μl)加入至100 μl 感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
   5) 42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
   6) 加入890 μl LB培養基，37℃振蕩培養60分鐘。
   7) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
   8) 挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長度大小。

注意事項

1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復使用，其PH的升高會減少產量。
2. 不論采取何種方法回收DNA，在回收過程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續操作。
3. 從膠上回收DNA時，應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
4. 連接反應時間是與溫度密切相關，因為反應速度隨溫度的提高而加快。通常可采用16℃連接4小時為宜，如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率；在選擇反應的溫度與時間關系時，也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
5. 連接反應的整個過程應注意槍頭的潔凈以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時應在冰上操作且動作迅速。
6. 連接反應應在25℃以下進行，溫度升高較難形成環狀DNA，影響連接效率。長片段PCR產物(2kb以上)進行連接時，連接反應時間應延長至數小時。
7. 進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
8. 用高效的感受態細胞(轉化效率≥1×10⁸ cfu/μg pUC19)，這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。