PCR產物的平末端克隆

噬菌體 T4 DNA 連接酶 噬菌體 T4 DNA 聚合酶 限制性內切核酸酶 閉環質粒 DNA 靶基因 DNA

ATP dNTP 溶液 KGB 廣域緩沖液

瓊脂糖凝膠 水浴箱

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10 mmol/L ATP

2 mmol/L dNTP 溶液（含四種 dNTP）

10X KGB 廣域緩沖液（1 mol/L 乙酸鉀，250 mmol/L Tris-acetate ( pH 7.6 )，100 mmol/L MgAc ( 含四水化合物），5 mmol/L β-巰基乙醇，100 μg/ml 牛血清白蛋白）

2. 酶與緩沖液

噬菌體 T4 DNA 連接酶

噬菌體 T4 DNA 聚合酶

用于克隆的限制性內切核酸酶

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

4. 核酸與寡核苷酸

閉環質粒 DNA ( 50 μg/ml）

靶基因 DNA ( 25 μg/ml) 及 PCR 擴增產物

5. 特殊設備

水浴箱預設水溫在 22℃

二、方法

1. 在一只微量離心管內，依次加入下列試劑，混勻：

50 μg/ml 閉環質粒載體      1 μl

25 μg/ml PCR 擴增靶 DNA 8 μl

10X KGB 廣域緩沖液         2 μl

H₂O( 見下面注釋）           5 μl

10 mmol/L ATP                1 μl

2 mmol/L dNTP                1 μl

限制性內切核酸酶            2 單位

T4 DNA 聚合酶                1 單位

T4 DNA 連接酶                3 單位

注意：用 H₂O 調整終反應體積為 20 μl 反應體系。

設置對照反應管，加入以上除了 PCR 擴增靶 DNA 的所有試劑。

2. 將連接反應混合液離心管在 22℃ 水浴溫育 4 h。

3. 將上述兩支試管內的連接反應混合液樣品各取 5 μl，用 10 μl H₂O 稀釋后，轉化具有抗生素抗性的感受態大腸桿菌受體菌。將這種轉化菌液涂布于含適當抗生素和 IPTG 與 X-gal 的培養基的平皿上。

4. 計算實驗管與對照管在培養皿上的菌落數。

挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色單菌落進行培養擴增，抽提質粒 DNA，利用質粒多克隆位點內的插入外源 DNA 片段側翼的酶切位點，用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑒定；也可以用菌落 PCR 予以鑒定。

5. 通過瓊脂糖凝膠電泳測定克隆 DNA 片段的大小（采用合適的 DNA marker 分子量作對照）。

6. 利用 DNA 序列分析、限制性內切核酸酶圖譜或 Southern 雜交進一步鑒定克隆的靶基因 DNA 片段的正確性。