Nature子刊：武漢大學團隊開發基于水凝膠的分子張力熒光顯微鏡

　　細胞外基質(ECM)剛性是影響多種生物過程的重要機械線索。然而，對剛性傳感的分子機制的理解受到當前細胞力測量技術的空間分辨率和力靈敏度的限制。

　　2023年10月5日，武漢大學劉鄭團隊在Nature Methods 在線發表題為“Hydrogel-based molecular tension fluorescence microscopy for investigating receptor-mediated rigidity sensing”的研究論文，該研究開發了一種以可控和可靠的方式在軟水凝膠表面功能化DNA張力探針的方法，使分子張力熒光顯微鏡能夠進行剛性傳感研究。

　　研究結果表明，成纖維細胞對底物剛性的反應是通過募集更多承受力的整合素和調節ECM的整合素采樣頻率，而不是簡單地超載現有的整合素-配體鍵，以促進局點粘附成熟。還證明了ECM剛性正調節T細胞受體-配體鍵的pN力和T細胞受體機械采樣頻率，促進T細胞活化。因此，在標準共聚焦顯微鏡上實現的基于水凝膠的分子張力熒光顯微鏡提供了一種簡單有效的方法來探索依賴于剛度的生物過程的詳細分子力信息。

　　作為一種主要的機械信號，細胞外基質(ECM)剛性已被證明影響許多關鍵的生命過程，包括干細胞分化、血小板活化和腫瘤轉移。為了了解細胞如何感知和響應ECM剛度，牽引力顯微鏡(TFM)或微柱陣列已被廣泛應用于測量細胞粘附在軟水凝膠表面所施加的機械力。例如，Prager-Khoutorsky等人發現基質硬度可能通過影響成纖維細胞中局灶粘連(focal adhesion, FAs)的機械轉導來改變成纖維細胞的極化。

　　Plotnikov等利用TFM研究了單個成熟FAs在不同剛度的水凝膠上產生的牽引力分布和動力學，發現單個FAs可以對ECM施加波動牽引力，探測基質剛度，促進細胞硬化。此外，在利用TFM研究水凝膠硬度與細胞牽引力之間的復雜關系后，研究人員提出，細胞通過一種稱為分子離合器(molecular clutch)的“actitinadaptor protein-integrin-ECM”連鎖傳遞和調節FAs介導的機械轉導。雖然TFM極大地促進了機械生物學領域的發展，但TFM較粗的力靈敏度(納牛頓)和~微米的空間圖像分辨率可能限制了人們對剛度感知的分子機制的理解，即細胞感知和響應其環境剛度的能力。

　　Stabley等人最近率先發明了分子張力熒光顯微鏡(mTFM)，該技術采用固定化的機械敏感熒光分子探針來成像和量化活細胞膜受體所經歷的pN水平的力。利用mTFM，研究人員能夠實時成像活細胞中整合素和T細胞受體(TCRs)等跨膜受體的分子力，并揭示了~pN水平的力通過單個受體介導的細胞粘附和T細胞活化傳遞。最近，作者開發了一種可逆剪切DNA張力探針(RSDTP)，擴大了可逆分子張力探針的力測量范圍，并揭示了機械強整合素(>56 pN)維持FA成熟。雖然mTFM可以在分子水平上測量細胞力，但該技術目前僅限于研究在覆蓋層或脂質雙分子層上擴散的細胞，這些細胞在機械上與軟ECM不同。目前很難用mTFM來繪制剛性傳感過程中的分子力，這主要是由于水凝膠復雜的化學和物理結構性質，這使得在其表面特異性地修飾分子張力探針具有挑戰性。

基于水凝膠的mTFM方法（圖源自Nature Methods ）

　　該研究開發了一種實驗程序，以可控和可靠的方式在軟水凝膠表面功能化DNA張力探針。此外，熒光納米球被共軛在同一個水凝膠表面，這使人們能夠將mTFM與傳統TFM耦合，并收集更全面的數據，包括分子力圖，凈細胞牽引力和力取向。使用基于水凝膠的mTFM，作者研究了ECM剛度如何調節受體介導的力傳遞過程。

　　研究發現，成纖維細胞對底物剛性的反應主要是通過募集更多的承受力的整合素和調節整合素在ECM中取樣的頻率，而不是通過增加FAs的整合素力的平均大小。此外，也發現ECM剛性對參與TCR -配體相互作用和TCR機械掃描動力學的pN力有積極影響，這最終促進了T細胞響應抗原識別的激活效率。該研究表明，基于水凝膠的mTFM可以用于研究細胞在軟水凝膠上擴散的機械轉導過程，軟水凝膠在機械上更類似于組織，并可能為細胞剛度感知和機械轉導的分子機制提供新的見解。