DNA酶I超敏感位點作圖

真核細胞

緩沖液 A EDTA 乙醇 裂解緩沖液 磷酸鹽緩沖液 臺盼藍染料 DNA 酶 I 稀釋緩沖液 DNA 酶 I 溶液 蛋白酶 K 溶液 RNA 酶溶液 酚：氯仿 SDS 緩沖液 TE

Sorvall H1000B 轉頭或等價物 帶螺帽的試管 振蕩水浴鍋

材料

緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的組成請參見附錄 1, 貯存液要稀釋到適當的濃度。

緩沖液 A
50 mml/LTris-Cl(pH7.9)
100 mmol/LNaCl
3 mmol/LMgCl₂
1 mmol/LDTT
0.2 mmol/L 苯甲基磺酰氟
緩沖液 A 貯存在 4°C。臨用前加入 DTT 和苯甲基磺酰氟。

EDTA（0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

裂解緩沖液
50 mmol/L Tris-Cl(pH7.9)
100 mmol/L KCl
5 mmol/L MgCl₂
0.05%(V/V) 皂角苷
50%(V/V) 甘油
200 mmol/L β-琉基乙醇
裂解緩沖液貯存在 4°C。臨用前加入β-巰基乙醇。

酚：氯仿

不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液

SDS 緩沖液
20 mmol/LTris-Cl（pH7.9)
100 mmol/LNaCl
70 mmol/LEDTA(pH8.0)
2%（m/V)SDS
SDS 緩沖液以室溫貯存。

TE

臺盼藍染料（0.4% m/V)
適量的染料溶于不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液中，室溫貯存。

酶和緩沖液

DNA 酶 I 稀釋緩沖液
10 mmol/LHEPES-KOH（pH7.9)
30 mmol/L CaCl₂
30 mmol/L MgCl₂
50%(V/V) 甘油

DNA 酶 I 溶液
用 DNA 酶 I 稀釋緩沖液把不含 RNA 酶的 DNA 酶 I 制品稀釋到濃度為 10 單位/ul。溶液貯存在-20°C。用牛胸腺 DNA 為底物，每毫升反應物每分鐘 A₂₆₀ 值變化 0.001 所需要 DNA 酶 I 的量定義為 1 個單位。

蛋白酶 K 溶液
用 50 mmol/LTris-Cl(pH7.9) 和 100 mmol/L NaCl 溶液溶解蛋白酶 K，使濃度為 0.2 mg/ml。溶液分裝后貯存于-20°C。

RNA 酶溶液
不含 DNA 酶的 RNA 酶制品溶于 TE(pH8.0)，使濃度為 0.5 mg/ml。

離心機和轉頭

Sorvall H1000B 轉頭或等價物

特殊設備

帶螺帽的試管（50 ml)

預設為 50°C 和 55°C 的振蕩水浴鍋

附加試劑
本方案步驟 18 中需要用到列在第 6 章方案 8 和 10 中的試劑。

細胞和組織

真核細胞
每次 DNA 酶 I 超敏感位點圖譜分析試驗需要用大約 10⁸ 個細胞。

方法

1. 細胞旋動培養或用三角瓶、培養皿培養，然后收獲約10⁸細胞，用25 ml 冰冷的不含鈣和鎂離子的磷酸鹽緩沖液洗兩次。
另外，如乘使用新鮮的組織，則如方案1步驟 1 所述分離核酸。

2. 用 1.5 ml 冰冷的裂解緩沖液重懸細胞沉淀。冰浴10 min 使細胞裂解。

3.10ul細胞裂解液和等體積0.4% 臺盼藍染料混和，放在裝有20x物鏡的顯微鏡下觀測。裂解的細胞和核酸吸收染料顯藍色，未裂解的細胞由于染料不能透過而仍然透明。繼續冰浴直至>80% 細胞裂解。

4. 在 4°C 以 1300 g(用 Sorvall H1000B 轉頭，轉速是 2500r/min) 離心 15 min, 從裂解細胞懸液中收獲核酸。

5. 小心去掉上清，用1.5 ml冰冷的緩沖液 A 重懸核酸沉淀。如步驟 4 所述離心收集核酸。

6. 用 4 ml冰冷的緩沖液 A 重懸核酸沉淀。

7. 標準 DNA 酶 I 溶液作一系列稀釋（用 DNA 酶稀釋緩沖液稀釋成 1/40，1/80，1/160，1/320，1/640，1/1280，1/2560)。稀釋液存放在冰上。

8.—系列管子從 1 到 9 作標記，步驟 6 中的核酸懸液各加 180ul 到每個管中。

9. 管 1 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀釋緩沖液，放置在冰上直到下面的步驟 12。管 2 加入 20ul 不含 DNA 酶 I 的 DNA 酶稀釋緩沖液，如下面步驟11所述放置。管 1 和管 2 作為對照。

10. 從管 3 到管 9, 依次加入 20ul 濃度遞增的稀釋液，即在管 3 加入 20ul 1/2560 稀釋液，在管 4 加入 20ul1/1280 稀釋液，等等 s

11. 管 2~9 在 37°C 放置 20 min。

12. 每管分 3 次加人 0.5 ml/L EDTA 終止反應，每次加 16.6ul, 在兩次加液間振搖。所有管子處理完畢后，每管加入 12ul RNA 梅溶液。反應在 37°C 孵育 30 min使核 RNA 降解。

13. 每管加入 40ul 蛋白酶 K 溶液消化核蛋白。上下吹打混和物使溶液混和均勻。每管加入 100ul SDS 緩沖液并再次混和均勻。管子在 50°C 旋轉培養 16 h。

14. 再加入 100ul 蛋白酶 K 溶液，繼續在 50°C 培養 2~3 h。

15. 混合物用酚/氯仿抽提 3 次。抽提時動作要輕。加入 3 倍體積冰冷的乙醇，冰浴 30 min 在臺式離心機上以 1200 g（用 Sorvall H1000B 轉頭，轉速 2400r/min) 離心收集 DNA 沉淀。去上清，用紙巾吸干管中殘存的乙醇。

16. 每管加入 200ul TE,55°C 旋搖過夜，使 DNA 溶解。
重要：為了徹底溶解 DNA 酶處理過的 DNA, 稱要長時間孵育。

17. 測定 DNA 重懸液的 A₂₆₀ 值，并估計其濃度。

18. 用一種限制性酶消化 DNA, 接著進行 Southern 印跡和雜交，方法如第 6 章方案 8 和 10 所述。瓊脂糖凝膠的每個泳道加 15~30ug 押用限制性酶消化的基因組 DNA。