DNA甲基化檢測技術全攻略

• 近年來涌現出不少 DNA 甲基化的檢測技術，少說也有十幾種。大致可以分為兩類：特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析，后者也稱為甲基化圖譜分析 (methylation profiling)。下面大家介紹一些常用的方法。

特異位點的甲基化檢測

甲基化特異性 PCR (MS-PCR)

這種方法經濟實用，無需特殊儀器，因此是目前應用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后，即可開展 MS-PCR。在傳統的 MSP 方法中，通常設計兩對引物 ，一對 MSP 引物擴增經亞硫酸氫鹽處理后的 DNA 模板，而另一對擴增未甲基化片段。

若第一對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點存在甲基化，若第二對引物能擴增出片段，則說明該檢測位點不存在甲基化。

這種方法靈敏度高，可用于石蠟包埋樣本，且不受內切酶的限制。不過也存在一定的缺陷，你要預先知道待測片段的 DNA 序列，并設計出好的引物，這至關重要。另外，若存在亞硫酸氫鹽處理不完全的情況，那可能導致假陽性。

亞硫酸氫鹽處理+測序

這種方法一度被認為是 DNA 甲基化分析的金標準。它的過程如下：經過亞硫酸氫鹽處理后，用 PCR 擴增目的片段，并對 PCR 產物進行測序，將序列與未經處理的序列進行比較，判斷 CpG 位點是否發生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個 CpG 位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。

聯合亞硫酸氫鈉的限制性內切酶分析法(COBRA)

DNA 樣本經亞硫酸氫鹽處理后，利用 PCR 擴增。擴增產物純化后用限制性內切酶 (BstUI) 消化。

若其識別序列中的 C 發生完全甲基化 (5mCG5mCG)，則 PCR 擴增后保留為 CGCG，BstU I 能夠識別并進行切割; 若待測序列中，C 未發生甲基化，則 PCR 后轉變為 TGTG，BstUI 識別位點丟失，不能進行切割。這樣酶切產物再經電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。

這種方法相對簡單，可快速定量幾個已知 CpG 位點的甲基化，且需要的樣本量少。然而，它只能獲得特殊酶切位點的甲基化情況，因此檢測陰性不能排除樣品 DNA 中存在甲基化的可能。

熒光定量法(Methylight)

此種方法利用 TaqMan? 探針和 PCR 引物來區分甲基化和未甲基化的 DNA。首先用亞硫酸氫鹽處理 DNA 片段，并設計一個能與待測位點互補的探針，隨后開展實時定量 PCR。這種方法最大的優勢在于其高通量和高敏感性，且無需在 PCR 后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。

Qiagen 就提供了多種預制的 MethyLight 分析。EpiTect MethyLight PCR Kit 包括了兩條甲基化敏感的 TaqMan 探針和 2 條甲基化不敏感的 PCR 引物。

隨著目標序列甲基化狀態的不同，只有 FAM 標記的亞硫酸氫鹽轉化的甲基化 DNA 特異的 TaqMan 探針，或只有 VIC 標記的亞硫酸氫鹽轉化的未甲化的 DNA 特異的 TaqMan 探針能與目標序列雜交。如果探針與 DNA 雜交則釋放出熒光信號。信號強度與 PCR 產物的量成正比，據此可計算出樣品的甲基化程度。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析

亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化 DNA 會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發現，因為甲基化 DNA 含有更多的 GC，相對更難熔解。根據熔解溫度及峰型的變化，可輕易區分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解 (HRM) 技術可檢出極微小的差別。

使用這種方法進行甲基化分析僅需一對引物，相比以往的方法更加快捷、簡便和精確。不過對儀器的要求頗高，需要帶 HRM 模塊的熒光定量 PCR 儀。目前市場上有多款 PCR 儀可滿足要求，包括 Illumina 的 Eco、QIAGEN 的 Rotor-Gene Q、羅氏 LightCycler 480 等。

焦磷酸測序

焦磷酸測序技術 (Pyrosequencing) 作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

通過準確定量單個連續的 CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序本身能檢測并定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據 C 和 T 的摻入量來定量確定單個位點的 C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準確檢測。由于焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。

QIAGEN 目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應用。PyroMark Q24 的強項在于可對多達 24 個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應用更適合在 PyroMark Q96 ID 上進行。

在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。而 PyroMark Q96 MD 裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的 DNA 模板進行準確測序。

為配合焦磷酸測序，QIAGEN 還推出了 PyroMark CpG Assays。這些預設計的甲基化分析使用特別定制的算法來設計出焦磷酸分析所用的 PCR 和測序引物，從而實現了基因組內特異靶點的甲基化分析。

基于芯片的甲基化圖譜分析

就甲基化圖譜分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多個公司都提供了這種工具，包括安捷倫的 Human CpG Island Microarray Kit，Illumina 的 HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen 的 Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array 和 Affymetrix 的 seven-array GeneChip? Human Tiling 2.0R Array Set。

平臺不同，過程也各異。安捷倫和 NimbleGen 的分析過程中，基因組 DNA 分成兩份，一份用來做 MeDIP，另一份作為對照。兩個樣品都標記熒光 (富集的樣品用 Cy5 標記，對照用 Cy3 標記)，然后與芯片雜交。芯片上每個探針的 Cy5/Cy3 強度比例顯示出該區域的甲基化程度。

安捷倫的 244,000-element array 覆蓋了 27000 多個人 CpG 島和甲基化不足區域 (UMR)。NimbleGen 的 Human 2.1M Deluxe Promoter array 也覆蓋了 27000 多個 CpG 島，還包括了 27000 多個啟動子區域，所有這些都是以 100 bp 的分辨率。然而這兩個平臺都不能以單核苷酸的分辨率報告甲基化狀態，但是 Illumina 的 Infinium 和 GoldenGate 分析做得到。

Illumina 的 Infinium HumanMethylation27 BeadChip 芯片覆蓋 27,578 個 CpG 位點。分析利用兩個位點特異的探針拷問這些化學上差異的位點，一個探針是為甲基化位點 (M 磁珠類型) 設計的，而另一個是為未甲基化位點 (U 磁珠類型) 設計的。

探針的單堿基延伸摻入了一個標記的 ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定拷問位點的甲基化水平。

此產品雖評價頗高，可惜目前已停產，取而代之的是 Infinium HumanMethylation450 BeadChip 芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了每個樣品中超過 45 萬個甲基化位點，實現了基因區域和 CpG 島的全面覆蓋。

此外，還附加了甲基化專家所精選的高價值內容，包括 CpG 島之外的 CpG 位點，在人類干細胞中鑒定出的非 CpG 甲基化位點，以及腫瘤和正常組織中差異表達的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格，讓它成為篩選 GWAS 群體的理想選擇。索取 HumanMethylation450 BeadChip 芯片的更多資料

相比之下，VeraCode GoldenGate 甲基化分析更適合高通量的驗證研究，它以溶液的形式分析 48 至 384 個用戶指定的 CpG 位點。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組 DNA 與分析 oligo 混合，oligo 與未甲基化位點的 U 互補，或者與甲基化位點的 C 互補。

雜交之后，引物延伸，并連接上位點特異的 oligo 來產生通用 PCR 的模板。最后，用標記的 PCR 引物生成可檢測的產物。據 Illumina 的產品專家介紹，其產品的最大優勢在于單個 CpG 位點的分辨率。其它分析將甲基化定位在一段區域，而通過 Illumina 分析，你能精確測定某個 CpG 位點的甲基化水平。索取 GoldenGate 甲基化分析的更多資料

高通量測序

新一代測序儀的飛速發展，使得測序成本大幅度下降，也使得甲基化組 (methylome) 的研究成為可能。近兩年，多個研究小組將傳統的甲基化工具 (如 DNA 的亞硫酸氫鹽轉化) 與目標基因組捕獲技術和高通量測序相結合，繪制出了多張甲基化圖譜。

而第三代測序技術的出現，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國 Pacific Biosciences 公司利用獨有的單分子實時 (SMRT) 測序技術，直接測定了 DNA 的甲基化。這項成果發表在《Nature Methods》雜志上。

SMRT 技術采用的是對 DNA 聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法。DNA 聚合酶催化熒光標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據其顏色鑒定出核苷酸。

當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。熒光脈沖的到達時間和持續時間產生了關于聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測 DNA 模板鏈中的修飾核苷酸，包括 N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和 5-羥甲基胞嘧啶。

研究人員使用這些動力學特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發現再結合 circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學修飾 (mA、mC 和 hmC)。

飛行質譜

美國 Sequenom 公司的 MassARRAY? 平臺也可用于 DNA 甲基化分析。MassARRAY? EpiTYPER? DNA 甲基化分析技術結合了堿基特異性酶切反應和 MALDI-TOF 檢測原理，可實現多重 CpG 的分析檢測。

堿基特異性酶切 (MassCLEAVE) 實驗由亞硫酸氫鹽處理待測 DNA 開始。經過亞硫酸氫鹽處理，DNA 中未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉變為尿嘧啶 (U)，由此在 DNA 模板中產生甲基化特異的序列變化。

利用 5' 末端帶有 T7-啟動子的引物進行 PCR 擴增，產物經 SAP (蝦堿性磷酸酶) 處理后用于堿基特異性的酶切反應。酶切后 DNA 片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，飛行質譜能測出每個片段的分子量，配套軟件 EpiTYPER 則能自動報告每個相應片段的甲基化程度。

MassARRAY 甲基化檢測無需任何熒光標記，每個反應覆蓋長達 500 bp 的多個 CpG 位點，且靈敏度高，可檢測低至 5% 的甲基化水平。目前有多家公司提供 MassARRAY 甲基化檢測服務，如北京毅新興業。