CRISPR正推動CART細胞快速前進

　　隨著人們對免疫治療興趣的增長，對更好的CAR-T細胞制造工具的需求也在增長。CRISPR技術的進步能解決這個問題嗎？

　　在過去的十年里，一種新的免疫治療工具進入了臨床。被設計成表達嵌合抗原受體的T細胞，即CAR-T細胞，已經被證明可以幫助血癌患者。2011年的一項關鍵研究使用第二代CAR-T細胞來實現大多數測試患者T細胞的持續激活和緩解。

　　一年后出現了另一個重大突破，兩個小組描述了一種名為CRISPR-Cas9的新型基因編輯工具，并演示了它在真核細胞中的應用。這兩份報告幫助開啟了基因編輯的新時代。

　　盡管基因編輯有可能改善細胞工程，但CAR-T細胞和CRISPR的交叉還需要幾年時間。

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　　尋找方法

　　從一開始，CAR  -T細胞就顯示出了巨大的殺癌潛力，但制造這些細胞既繁瑣又復雜。

　　最初，T細胞工程依賴于慢病毒或逆轉錄病毒載體將DNA片段導入細胞進行同源重組。病毒載體允許DNA片段的穩定整合和長期表達。然而，獲得這些載體所需的臨床級試劑非常昂貴，而且這些載體只能攜帶有限數量的DNA，而這些DNA有可能隨機整合到基因組中。

　　為了推進CAR-T細胞治療，研究人員需要找到一種更有效的方法來設計長CAR序列。

　　CRISPR驅動CAR的發展

　　從一開始，CRISPR就像是制造T細胞的理想方法。這是一個簡單的過程，具有最小的脫靶效應，適用于多種細胞類型。但CRISPR在一個領域遇到了困難。

　　CRISPR-Cas9通過產生靶向雙鏈DNA (dsDNA)斷裂，然后通過細胞的非同源末端連接途徑修復，從而有效地產生小的突變。然而，當使用同源導向的修復機制插入外源DNA時，CRISPR編輯的效率可能低得可憐。然而，插入DNA對于制造CAR-T細胞至關重要。

　　位于奧馬哈的內布拉斯加大學醫學中心(University of Nebraska Medical Center)的基因工程師Channabasavaiah Gurumurthy表示："Easi-CRISPR是一種更好的工具，適用于同源性導向修復。"

　　Gurumurthy和他的合作者發現，當使用CRISPR將DNA插入細胞時，長單鏈DNA (ssDNA)是比雙鏈DNA更有效的模板。使用Easi-CRISPR，長ssDNA與含有Cas9和導向RNA的預組裝復合物一起被注入，導致更高的靶標編輯率和更低的脫靶編輯率。之前的報道顯示，化學合成的具有2-甲氧基和硫代磷酸基團修飾的單導向RNA (sgRNA)增強了原代細胞的細胞內穩定性和編輯效率。此后，CRISPR-Cas9似乎開始成為T細胞內產生缺失和插入的有效工具。

　　去年，Alexander Marson、Gurumurthy和他的同事們利用Easi-CRISPR對人類T細胞的結構和功能進行了重新編程，且不需要病毒載體。本研究表明，將ssDNA作為同源性導向的修復模板對T細胞進行CRISPR編輯，與dsDNA模板相比，能夠更準確、更有效地進行大規模的基因插入，并且脫靶整合概率更低。

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　　展望未來

　　雖然有希望，但還有一個重要的考慮。"長ssDNA序列很難在實驗室中產生，尤其是在基因編輯實驗中需要高濃度的長ssDNA，" Marson實驗室的成員、該研究的第一作者Theodore Roth說。

　　一些公司和研究開發人員正試圖解決這個問題，他們正在研究有效生成大量長ssDNA的方法。總部位于新澤西州皮斯卡塔韋(Piscataway)的全球生物技術公司GenScript以其領先的DNA合成技術而聞名。該公司最近開始提供數千個核苷酸長度的ssDNA，數量可達100微克--這是使用CRISPR進行T細胞重編程的理想選擇。GenScript也是為數不多的提供完整的CRISPR解決方案的公司之一，包括HPLC純化的、化學合成的sgRNAs，并通過末端修飾來增強CRISPR編輯。

　　基因編輯正在改變研究人員研究細胞工程的方式。像Easi-CRISPR這樣的方法，連同DNA和RNA合成的改進，將進一步加強CAR-T細胞工程的努力，最終改善癌癥治療和人類健康。

　　參考資料：

　　【1】CRISPR expands CAR T cell possibilities

　　【2】Porter， D.L.， et al. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N Engl J Med 365， 725-733 (2011). DOI： 10.1056/NEJMoa1103849

　　【3】Jinek， M.， et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 3337， 816-812 (2012). DOI： 10.1126/science.1225829

　　【4】Cong， L.， et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339， 819-823 (2013). DOI： 10.1126/science.1231143

　　【5】Miura， H.， et al. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nat Protoc. 13， 195-215 (2018). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nprot.2017.153

　　【6】Hendel， A. et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol. 33， 985-989 (2015). DOIhttps：//doi.org/10.1038/nbt.3290

　　【7】Roth， T.L.， et al. Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting. Nature 559， 405-409 (2018). DOI https：//doi.org/10.1038/s41586-018-0326-5