魏文勝：基因組編輯平臺技術及未來產業運用發展趨勢

　　“基因組編輯未來產業運用發展是如今的熱點，利用這個技術，不管做動植物轉化改造還是醫藥領域應用，可以做的事情非常多，但是具體怎么落地？我跟大家一樣，有的時候會覺得無從下手，所以今天我會更多從技術層面給大家做一個簡單的介紹。”

　　△魏文勝 北京大學生命科學學院教授

　　以下是正文：

　　各位下午好！謝謝組委會邀請我來參加這次會議。我今天分享的是基因組編輯平臺技術及未來產業運用發展趨勢。

　　基因組編輯未來產業運用發展是如今的熱點，利用這個技術，不管做動植物轉化改造還是醫藥領域應用，可以做的事情非常多，但是具體怎么落地？我跟大家一樣，有的時候會覺得無從下手，所以今天我會更多從技術層面給大家做一個簡單的介紹。

　　通俗來說，基因組編輯就是用一把分子剪刀對基因進行準確的編輯。

　　最近兩三年特別是這一兩年，大家說的更多的是CRISPR，而不是基因組編輯，我想跟大家強調一下基因組編輯技術不僅僅只CRISPR，CRISPR只是基因組編輯多種實現技術中的一種。

　　首先，我們來回顧下整個技術發展過程

　　在CRISPR出現以前，也有很多可以做基因組編輯的工具，特別是以ZFN為代表的，就是zinc finger nuclease，它其實是已經有專門公司產品化的這樣一個技術，但是它有非常多的問題，我在中間就不展開講了。之后就是TALEN或是TALE技術，然后才是最新的CRISPR。

　　CRISPR其實是相對低等的原核生物中存在的一種獲得性免疫機制，細菌也有天敵，我們叫它們噬菌體，這些噬菌體本質上屬于病毒。在噬菌體和細菌不斷斗爭的過程中，細菌進化出一套機制，能夠讓細菌記住是誰侵犯過它，它把噬菌體基因編碼區的片段整合到它特殊的CRISPR序列里面，當下一次這種病毒侵染的時候，細菌能夠根據這些片段產生一些小RNA，這些小RNA能準確識別噬菌體的基因組，并且通過細菌內的一個核酸酶，cas9，將噬菌體的基因組切斷，所以這是一種天然存在的，能夠識別并且切斷DNA的機制。 這套系統工作原理的發現，是CRISPR能夠運用到基因組編輯上的基礎。搞明白CRISPR這個系統是怎么工作以后，我們迅速把它應用到基因編輯上去，這個應用最重要里程碑的是Science在2012年夏天發表的文章，證明這個可以做編輯。2013年出的兩篇science文章包括其他一些文章進一步坐實在在人源或真核動物細胞里面可以做這個事情。

　　早一代的技術叫TranscriptionActivator-Like Effector，TALE。TALE也是我們從細菌學到的一個小小的花招，在89年的時候大家就已經發現有一些類細菌有第三類的分泌系統，它可以把自己的蛋白跨界送到自己的宿主，比如說植物的宿主或者動物宿主里面去。這些蛋白有非常重要的特點就是這些蛋白中間有非常多的蛋白重復區域，這些重復區域可以結合到操縱子上然后影響一批基因的表達。為什么會有重復？

　　09年的時候這個問題被搞清楚了，這些重復差不多是34個氨基酸的重復，這些氨基酸中12、13位的地方是高度可變區，其它部分都是一樣的。這么多重復是利用可變區的2個氨基酸，我們給它名字叫RVD。RVD決定是否可以識別或識別什么樣的DNA堿基，大家知道4個堿基ATCG來決定它的序列變化，也就是如HD識別C。兩篇science第一次把它解碼出來后大家非常興奮，因為大家可以按照意愿來直接識別一段DNA序列。這是基因編輯技術開始起飛的時候。這就是從TALE變成TALEN的由來。

　　TALE和CRISPR各有特點，CRISPR用RNA來識別DNA，TALE或TALEN是用protein蛋白來識別DNA，這就涉及到了分子克隆的問題，使得定制和使用TALE的門檻比較高。單純從針對一個基因的編輯效率、脫靶率這些實用性來說，其實很難比較出CRISPR和TALE誰更優秀，甚至更多的研究認為TALE有更高的效率和更低的脫靶率。

　　那么TALE確實有些不能干的事情，比如它做不了高通量的篩選，說到這個早上閻海教授舉了例子。功能性的基因篩選廣泛的被應用于生物醫藥領域中，其實大部分實驗室整天都在干這件事情，功能性的基因篩選廣泛應用在生物醫藥領域里，是一項非常重要的基礎性工作，它能幫我們基因與功能之間的關系應用。如果用它來研究疾病，就能幫我們找出基因與疾病之間的關系。之前有一個平臺叫RNAi，我們大概五六年前結合生物測序建立一個體系。我們用RNAi這種方法找到了抗生素引發腹瀉的一個關鍵因素。臨床上經常發現，服用抗生素的病人很容易引發腹瀉，這種腹瀉大部分是由一種叫艱難梭菌的細菌造成的，在美國CDC發布的報告了，每年因為艱難梭菌感染造成的醫療花費，超過10億美金，我們一直在研究這其中的機制，并且用RNAi技術找到了。在這個過程中，我們意識到RNAi有非常多的問題，假陽性非常高，所以我們一直在尋找一個更好的方法，結合CRISPR這個工具，我們做成了更好的篩選平臺。 它的假陽性非常非常低。從它的理論來講，也是合理的，因為通過CRISPR，我們修改了基因組，直接讓基因的功能消失了，而RNAi只是在部分減弱了基因的功能。

　　當我們建立這樣一個方法學之后，就用兩種毒素蛋白來驗證，因為我們知道這兩種毒素入侵細胞的關鍵因子是什么，也就是我們知道陽性對照。也就是我們可以用基因組編輯的方法高通量的迅速的建立因果關系。更加重要的是我們在前邊篩選的基因，我們逐一做了驗證，發現他們確實未被發現的，在毒素入侵細胞過程中發揮關鍵作用的新因子。

　　這個方法有非常多的應用，當年所有用RNAi平臺所做的工作，都可以回到CRISPR來，用同樣的方法做高通量篩選，我舉一個非常典型簡單的例子，我們做的HCV丙型肝炎病毒，利用這個方法，我們迅速就發現了三個已知的關鍵因子。，它給我們非常明確的因果關系。這件事情新藥研發有很重要的意義，因為藥物靶點的確定是整個下游的研發的基石，有非常大的需求，我們對編碼基因可以用CRISPR方法進行迅速的篩選。

　　大家越來越關注非編碼的區域有什么作用

　　在這個平臺的基礎上，我們進一步發展了雙gRNA篩選系統，這個系統通過直接在基因組上刪掉大片段的方式，不僅能找出編碼基因與疾病之間的關系，也可以用來研究現在很熱門的miRNA，lncRNA，我們已經用這種方法找到一些lncRNA，并且能夠證明這些lncRNA跟前列腺癌細胞轉移有緊密的因果關系的，它們可能都是對抗癌細胞轉移的新的靶位點。

　　那么哪些是實現以上暢想的最關鍵的因素呢? 我看來，安全性，系統導入或者說給藥方法，以及效率，是急需解決的問題。安全性不需要多說，肯定是最重要的，目前整個領域都在研究如何控制基因組編輯工具的脫靶效應，在這方面，TALE有可能更有優勢。系統導入方法方面，目前傾向于使用病毒工具的依然居多，考慮到病毒載體本身的限制，由于TALE的個頭更大，CRISPR確實有一些優勢。但是如果把基因組編輯與細胞治療相結合，在體外進行編輯，這個問題就會簡單很多。我們把基因組編輯的這些工具，比如CRISPR或者TALE導入到細胞以后，并不是所有細胞都會乖乖的被修改的。這就有一個效率的問題。從這個角度說，，如果用于科研目的，目前很多人還是滿意的，但如果未來真的用于醫療，那肯定還不夠好。你可以向做過這項工作的人求證，想完成一項基因組編輯工作并不是非常容易的，對此我們做了非常特殊的報告系統，對于基因組編輯的效率有巨大的提升，可以提升到90%。甚至可以同時高效率的編輯5個基因。

　　我用這個簡單的例子來告訴大家，其實基因編輯有非常多需要提高提升的空間，效率提升在醫藥領域里面顯得至關重要。

　　回到CRISPR和TALEN兩大技術，用誰呢

　　回到TALEN或TALE，它通過RVD識別，蛋白識別DNA其實是比較嚴謹的。大家不用或者避免用TALE或者TALEN，它最大瓶頸是蛋白組裝非常困難，構建一個基因組編輯所需的TALEN，大概需要幾個星期的時間。由于我們很早就進入到這個領域內，我們擁有一套獨特的方法，可以快速大量的獲得TALE，所以這個門檻對我們來說是不存在的。

　　還有另外一個事情，前面說的RVD，自然界中天然存在的大概有25種左右，但我們依靠我們獨特的TALE快速組裝方法，嘗試了兩種氨基酸所有的400中組合，并找到了天然并不存在的，能夠特異性識別有表觀遺傳修飾堿基的RVD。如甲基化修飾，甲基化修飾對蛋白識別堿基的影響是巨大的。我們同樣的方法把修飾的篩了一遍，發現非常有趣非常好用的新的RVD。未來對于一些醫療有一些特殊的應用。

　　前面我講了很多科研的東西，回過頭了，如果把基因組編輯拿過來用于治療領域，哪些領域是最容易捏的軟柿子呢？

　　舉例來說明一個基因組編輯應用的巨大潛力

　　單基因遺傳病，比如地中海貧血癥。這是最容易想到的疾病，因為這些疾病發病的原因就是單個基因出錯了，我們用基因組編輯的方法，把錯誤的地方改過來，不就可以了嗎? 這是目前大家廣泛發力的一個領域。感染性疾病，用基因組編輯的方法治療感染性疾病，這個里面的關系好像不是很直接，我舉個例子，HIV是威脅巨大的感染性疾病，早在TALE之前，就有公司使用歷史更為悠久的基因組編輯工具ZFN，使用ZFN可以把T細胞上一個HIV侵染的關鍵因子CCR5基因去除，沒有了CCR5的T細胞就不會再被HIV攻擊了。通過這種方式，可以制造出一些對HIV免疫的特殊T細胞，并通過這些T細胞來維持病人一定的免疫能力。目前這個療法，已經做到了II期臨床。基因組編輯技術不但單獨可能作為一種療法，也可以與很多其他的治療方法相結合。比如現在很熱門的免疫治療。單單是與T細胞相關的方面，我們就可以暢想，利用基因組編輯的方法，去除掉T細胞上與排斥反應相關的基因，就可以實現T細胞的異體移植，這個想法已經由一個法國公司實現了。我們還可以考慮用基因組編輯的方法，將CAR高效且定點插入T細胞的基因組中，這樣就使得CAR的導入更加可控，擺脫由于慢病毒導致的問題，我們甚至可以考慮直接將T細胞表面的PD-1去除，用來直接對抗癌癥。

　　當然我們還會面臨倫理挑戰，使用基因組編輯技術，我們真的可以部分扮演上帝了。那么我們的底線是什么？或許所有條條框框都是等著人類突破的，但是我們的確有這個責任要提前想這個事情。

　　最后我想和大家分享一下產業的信息

　　我上網搜了一下國際知名的專注于基因編輯的公司，這里面大部分公司還都處于研發階段，但它們中有的公司已經在納斯達克上市了，有些也即將上市，這是因為人們看好他的前景。在這股浪潮中，我想中國也不會缺席，基因組編輯技術的確是革命性技術、革命性機會，之前很多不能想的事情，現在突然感覺到有著力點，這讓我們這些一直做這個領域的人非常興奮。當然具體實踐起來需要非常多的積累和參與，我就說到這里，謝謝！