角蛋白酶功能特性及應用

皮膚真菌與角蛋白有著特殊的親合關系，往往侵犯皮膚的角質層、甲、毛發等部位。20世紀40年代，科學家們相繼發現許多微生物能分泌一類具有角蛋白水解活性的酶，稱為角蛋白酶，并進行了有關研究，但進展緩慢。近十年來，隨著分子生物學技術的發展，角蛋白酶再次成為研究的熱點，并取得了明顯的進展，本文就角蛋白酶的生物學特征、研究進展及其在皮膚科和美容領域的可能應用進行綜述。

　　1 角蛋白酶的生物學特點
　　角蛋白酶是微生物產生的一類具有角蛋白水解活性的酶，許多皮膚真菌可分泌角蛋白酶，如須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、雞禽毛癬菌、石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、新霉素鏈霉菌、密旋鏈霉菌、短帚霉、黃曲霉、白色念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌等。一些細菌也可產生角蛋白酶，如棲息微球菌、表皮葡萄球菌和地衣芽孢桿菌等。Lucas FS等[1]在對牧場土壤產角蛋白酶細菌分離中發現產角蛋白酶細菌具有多樣性，可為桿菌屬、噬細胞菌屬、放線菌屬或蛋白菌屬（Proteobacteria）。最近，Kim JS [2]發現一種新的細菌Fervidobacterium pennivorans 能夠產生稱為fervidolysin的角蛋白酶。Riffel A等[3]從家禽廢物中分離出一種新的能完全降解羽毛的產角蛋白酶的細菌，經形態、生化及16S rRNA鑒定為Chryseobacterium sp菌株 kr6。角蛋白酶來源不同，其結構、理化性質、活性和底物也不同。這些酶多數屬于細胞外酶，個別為細胞內酶。根據角蛋白酶反應的最適pH值不同可以把角蛋白酶分成酸性酶和堿性酶二大類；多數角蛋白酶反應的最適溫度在45℃～50℃，而念珠菌酸性蛋白酶（CAP）的最適溫度為37℃。多數酶的活性表達依賴低濃度二價金屬離子（Ca2+、Mg2+等），而一些重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+等）、1,10-鄰二氮雜菲和EDTA則抑制其活性[3，4]。不同的角蛋白酶有不同的特異性抑制劑，分別屬于不同酶家族的抑制劑，提示角蛋白酶具有不同的進化起源。角蛋白酶的產生需要底物的誘導，如用蛋白胨培養的犬小孢子菌不產生角蛋白酶，但在培養基中加入人發后，則可以產生角蛋白酶。角蛋白酶的底物范圍相當廣泛，除角蛋白外，還包括多種多肽、膠原蛋白、酪蛋白、彈性蛋白、血紅蛋白、明膠和卵蛋白等。但一些角蛋白酶底物范圍卻較窄，如雞禽毛癬菌酶只能利用鳥類羽毛，因此，它只感染鳥類。而密旋鏈霉菌釋放的絲氨酸蛋白酶，P1位點對底物的精氨酸和賴氨酸有專一性，而P1'位點對苯丙氨酸和精氨酸有專一性。該酶對底物表現出高度的立體選擇性和二級結構專一性[5]。角蛋白酶反應的水解產物因角蛋白酶的不同而不同，須癬毛癬菌角蛋白酶I的水解產物是氨基酸，顆粒發癬菌角蛋白酶則是短肽。

　　2 角蛋白酶與免疫
　　角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，是研究真菌疫苗的一個候選抗原，能否利用角蛋白酶作為疫苗來預防動物和人的皮膚真菌感染一直是人們關注的問題，因此，研究角蛋白酶與宿主免疫的相互關系非常重要。Descamps F等[6]認為針對真菌抗原的循環抗體與皮膚真菌感染的易感性及疾病的恢復無明顯的關系，與體液免疫不同，細胞免疫反應與皮膚真菌感染的康復及抗病性的獲得密切相關，針對真菌抗原的遲發型超敏反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)與皮損的恢復以及防止復發密切相關，缺乏DTH則與真菌的易感性和慢性感染相關。將真菌感染鼠的Th細胞轉移至易感鼠可獲得過繼免疫，也說明了細胞免疫反應在真菌感染中的重要性。Mignon BR等[7]最早觀察了天然的犬小孢子菌外抗原和純化的重組犬小孢子菌31.5kDa角蛋白酶對豚鼠犬小孢子菌實驗感染模型體液免疫和細胞免疫反應的影響，發現純化的角蛋白酶并不誘導豚鼠產生抗角蛋白酶IgG，角蛋白酶不引發或僅引發微弱的DTH，提示31.5kDa角蛋白酶不是犬小孢子菌感染的重要抗原。Brouta F等[8]用ELISA法和淋巴細胞增殖分析方法觀察了天然的犬小孢子菌外抗原和純化的重組角蛋白水解金屬角蛋白酶(recombinant keratinolytic metalloprotease，r-MEP3)對豚鼠犬小孢子菌實驗感染模型體液免疫和細胞免疫的影響，發現外抗原和r-MEP3均可促進豚鼠的體液免疫和細胞免疫。Woodfolk JA等[9]也發現重組紅色毛癬菌角蛋白酶Tri r2激發速發型超敏反應和DTH，認為對真菌特異性抗原的低反應性是造成人類真菌感染的原因。　　Descamps F等[10]用純化的重組犬小孢子菌31.5 kDa角蛋白酶和天然的犬小孢子菌外抗原作為疫苗免疫豚鼠，并觀察其對豚鼠犬小孢子菌實驗感染模型的作用。結果發現角蛋白酶和外抗原均可引起強烈的體液免疫和細胞免疫反應，但反映皮損嚴重程度的評分與對照組之間無顯著差異。說明犬小孢子菌31.5kDa角蛋白酶誘導的特異性免疫反應不能對犬小孢子菌的感染起保護作用。因此，在利用角蛋白酶研制真菌疫苗的道路上仍然面臨著諸多困難。

　　3 角蛋白酶與皮膚病的治療
　　角蛋白酶是皮膚真菌重要的侵襲因子，因此，能否利用角蛋白酶抑制劑或者角蛋白酶單克隆抗體抑制角蛋白酶的作用，削弱皮膚真菌的侵襲性，從而達到治療皮膚真菌感染的目的，是今后研究角蛋白酶與皮膚真菌感染相互關系的一個重要方向[11]。迄今為止，尚缺乏研制角蛋白酶單克隆抗體在體表中和角蛋白酶削弱皮膚真菌的侵襲性報道。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，利用角蛋白酶改善藥物在角蛋白中的通透性，提高皮膚外用藥物的療效，特別是在銀屑病、角化過度性皮膚病（神經性皮炎、慢性濕疹等）和甲病中的治療應用值得研究。角蛋白酶也可以應用于美容護膚品，幫助活性因子透過皮膚屏障，去除皮膚多余角質，實現皮膚的深層護理。角蛋白酶能水解毛發角蛋白，利用角蛋白酶進行脫毛，治療多毛癥也可能具有良好的應用前景。

　　4 角蛋白酶與瘋牛病
　　瘋牛病，即牛海綿狀腦病（Bovine Spongiform Encephalopathies，BSE），1986年首次在英國發現，其病原是一種不同尋常的傳染因子，該因子與羊瘙癢病的致病因子十分相似。一般認為由于牛食用了含有病原的反芻動物蛋白飼料而引起。人類海綿狀腦病(克雅氏病Creatzfeldt-Jakob disease，CJD)，其病原與瘋牛病有關。由于Prion蛋白（Prion Protein，Protease resistant Protein，PrP）是唯一可檢測到的與本病感染有關的大分子。因此，絕大多數學者認為這兩個病都是由PrP引起。該蛋白是一種正常宿主蛋白的異構體，與宿主蛋白相比，對蛋白酶具有較強的抵抗力。PrP分子量為2.7×104～3.0×104道爾頓，是一種以糖蛋白為主體的特殊的致病因子。PrP有二種，一種正常機體內存在的由染色體編碼的對蛋白酶敏感的PrPc，這種PrPc在某種尚不清楚的機制作用下產生翻譯后的轉化，從含有大量α螺旋的構象轉化成含大量β折疊的構象，隨著立體構象的改變，其化學性質也變成對蛋白酶有抗性的PrP，稱為PrPres或PrPsc。PrPsc具有致病性，致病PrPsc與正常PrPc接觸可使正常PrPc轉化成致病PrPsc。有學者認為是通過逆轉錄指導的自身復制，但是至今，其具體復制機制尚不明確。Langeveld JP等[12]用地衣芽孢桿菌PWD-1菌株產生的細菌角蛋白酶測試了完全降解瘋牛病和羊瘙癢病動物腦干組織中PrPsc 的條件，結果顯示只有在大于100℃的熱預處理的條件下，才能廣泛酶解PrPsc，使之用免疫組化方法無法檢測到。其他的枯草桿菌蛋白酶如蛋白酶K和蛋白酶L也同樣有效。因此，角蛋白酶可能被應用于醫療和實驗儀器的凈化；利用角蛋白酶滅活PrPsc，最終實現瘋牛病的防治有待于進一步的研究。目前，角蛋白酶已經廣泛應用于動物飼料生產、羽毛和皮革類廢物生物降解以及皮革工業中的脫毛等方面，角蛋白酶降解PrPsc的作用，將大大地提高角蛋白酶在這些領域中的應用價值[13]。

　　5 基因工程角蛋白酶的研究
　　以往對角蛋白酶的研究工作主要集中于菌種篩選、酶的提取純化和活力測定等基礎工作，對酶結構和基因表達的研究極少。20世紀90年代，隨著分子生物學技術的發展，國外的一些學者開始進行角蛋白酶基因工程表達和分子結構等方面的研究。Lin X等采用隨機引物PCR的方法獲得了編碼地衣芽孢桿菌PWD-1菌株分泌的角蛋白酶基因（Ker A）的全序列，Ker A基因與地衣芽孢桿菌NCIMB6816編碼Carlsberg枯草桿菌蛋白酶的基因具有97％的同源序列。將Ker A基因轉染產酶缺陷型枯草桿菌DB104菌株，該轉化菌株能在含羽毛的培養基和LB培養基中產生活性角蛋白酶[14～16]。Woodfolk JA等從紅色毛癬菌cDNA文庫克隆了Tri r4，并在畢赤酵母（Pichia pastoris）中表達了重組蛋白Tri r4，一個含726個氨基酸的蛋白質，屬絲氨酸蛋白酶家族。另外，還在埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）菌株BL21中表達和發現了Tri r2，一種毛癬菌的新抗原，編碼412個氨基酸，屬D類枯草桿菌蛋白酶亞家族；通過SYBYL分子模建軟件包進行分子模建，明確了Tri r2的三維分子結構和免疫優勢T細胞抗原決定簇的分子位點[9,17，18]。2002年，Descamps F等[19]成功地從犬小孢子菌中獲得了3個具有角蛋白水解活性的枯草桿菌蛋白酶的基因全序列，并通過畢赤酵母系統重組表達了SUB3角蛋白酶[6]。Wang JJ 等[20]用枯草桿菌表達系統和埃希氏大腸桿菌系統表達了角蛋白酶—鏈親和素融合蛋白，并用生物素—親和素一步法純化了融合蛋白，提高了純化效率和角蛋白酶的穩定性。上述研究為角蛋白酶的工業化生產與應用提供了良好的工作基礎。由于微生物在底物誘導狀態下表達角蛋白酶，而在非底物誘導狀態下不表達角蛋白酶，因此，差異PCR等方法不失為發現角蛋白酶新基因的良好手段。
　　綜上所述，角蛋白酶作為皮膚真菌重要的侵襲因子，一方面，在皮膚真菌感染的發病中起重要作用；另一方面，角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，其在生物醫藥、美容、廢物處理及動物飼料生產等方面具有廣闊的應用前景。

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