ACSNano：基于本征無序蛋白域的相分離合成細胞器

　　代謝工程和合成生物學工具有潛力馴化微生物細胞工廠，這些工廠能夠有效生產大量化學品和材料，包括大宗和特種化學品、生物燃料、聚合物和藥物。所需產物的微生物生產可以通過在微生物底盤細胞中異源表達特定酶或整個合成途徑來實現。過表達靶途徑酶并減少甚至消除內源性競爭途徑中酶的表達的策略已被廣泛使用。

　　2023年5月16日，江南大學沐萬孟團隊在ACS Nano（IF=18）在線發表題為 “Phase-Separated Synthetic Organelles Based on Intrinsically Disordered Protein Domain for Metabolic Pathway Assembly in Escherichia coli” 的論文，該研究報道了基于本征無序蛋白域的相分離合成細胞器，用于大腸桿菌的代謝途徑組裝。

　　簡單地高水平過表達工程途徑或直接刪除特定宿主菌株中的某些代謝節點可能會帶來神秘的困境。例如，由此產生的代謝負擔和流量失衡會擾亂自然細胞過程，降低目標產品的生產效率。作為一種有效的翻譯后調節策略，將多途徑酶空間組織到構建的人工支架中以加強靶途徑代謝通量越來越受到關注。這種多酶聚類方法可以促進代謝通道的形成，這可以帶來幾個明顯的優勢，例如防止有毒中間體的積累，緩解中間體的擴散，以及通過增加酶和底物的局部濃度來提高轉化效率。

　　幾項研究開發了多種多樣的多酶組裝工具。例如，Lee等人開發了一種細胞支架系統，該系統由C末端修飾的Pdu（PduA*，在大腸桿菌中形成中空絲）、來自弗氏檸檬酸桿菌細菌微室（BMC）的單殼蛋白和兩種互補的從頭卷曲螺旋肽組成。靶蛋白（丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶）被成功地募集到細胞內絲上，從而提高了工程大腸桿菌菌株的乙醇產量。最近，研究人員受到I型模塊化聚酮合成酶（PKS）的啟發，開發了一種名為模擬PKS酶組裝線（mPKSeal）的策略，通過該策略將順序途徑酶組裝成多酶復合物。具體而言，將I型順式AT PKS的對接結構域標記到蝦青素生物合成途徑酶上，進行多酶組裝，使蝦青素的產量提高了2.4倍。

文章模式圖（圖源自ACS Nano ）

　　作為典型的低復雜度序列之一，來源于秀麗隱桿線蟲的LAF-1 RGG結構域已被證明可以在體外和體內進行液-液相分離（LLPS）并形成蛋白質縮合物。該結構域包含168個殘基，具有頻繁出現的精氨酸-甘氨酸?甘氨酸（RGG）序列基序。據報道，與單個RGG結構域相比，增加RGG結構域的化合價會產生更穩健的LLPS趨勢。此外，將肽或貨物蛋白基因融合到RGG結構域仍然可以觸發相分離并形成特定的生物分子縮合物。這些特性使RGG蛋白成為構建合成無膜細胞器（MLOs）并進一步將靶蛋白募集到隔室中的一種有前途的替代品。

　　該研究表明RGG結構域可以作為理想的蛋白質支架，在工程大腸桿菌菌株中形成無膜合成細胞器和募集途徑序列酶，從而改善目標產物的生物合成。具體而言，研究者證明了由綠色熒光蛋白融合的單個RGG結構域的過表達在大腸桿菌中產生了不同的蛋白質縮合物。接下來，研究者探討了培養溫度、表達水平和RGG結構域的不同價態對細胞內蛋白質縮合物形成的影響。然后，研究者證明了不同的細胞內容物蛋白可以通過直接與RGG結構域融合或與不同的蛋白質相互作用基序合作而被募集到合成區室。2′-巖藻糖基乳糖（2′-FL）從頭生物合成途徑用于測試此處構建的RGG介導的合成無膜細胞器系統的潛力。通過將順序酶聚集到合成區室中，與具有未組裝途徑酶的菌株相比，2′-FL的滴度顯著提高。