被分離組分在柱中的洗脫原理

一、基本概念和術語

1.色譜圖和峰參數
⊕色譜圖（chromatogram）--樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號－時間曲線，又稱色譜流出曲線（elution profile）.
⊕基線（base line）--流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。
⊕噪音（noise）――基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。
⊕漂移（drift）基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。
⊕色譜峰（peak）--組分流經檢測器時相應的連續信號產生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱性正態分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰（leading peak）和脫尾峰（tailing peak ）.前者少見。
⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子（symmetry factor）或不對稱因子（asymmetry factor）《中國藥典》規定T應為0.95～1.05。T<0.95為前延峰，T>1.05為拖尾峰。
⊕峰底――基線上峰的起點至終點的距離。
⊕峰高（Peak height,h）――峰的zui高點至峰底的距離。
⊕峰寬（peak width,W）--峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W=4σ。
⊕半峰寬（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半處的峰寬。W h/2＝2.355σ。
⊕標準偏差（standard deviation, σ）--正態分布曲線x=±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰寬的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
⊕峰面積（peak area,A）――峰與峰底所包圍的面積。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h

2.定性參數（保留值）
⊕死時間（dead time,t0）--不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。
⊕死體積（dead volume,V0）――由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內固定相顆粒間隙（被流動相占據，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其他3部粉只起峰擴展作用。為防止峰擴展，這3部分體積應盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）
⊕保留時間（retention time,tR）--從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間。
⊕保留體積（retention volume,VR）--從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F＊tR .
⊕調整保留時間（adjusted retention time,tR’）--扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間（reduced retention time）。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，tR’只決定于組分的性質，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0
⊕調整保留體積（adjusted retention volume,VR’）--扣除死體積后的保留體積。VR=VR-V0 或VR=F＊tR’

3.柱效參數
⊕理論塔板數（theoretical plate number,N）用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。
N取決于固定相的種類、性質（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。如果峰形對稱并符合正態分布，N可近似表示為：
N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2
W：峰寬 ； σ：曲線拐點處峰寬的一半，即峰高0.607處峰寬的一半。
N為常量時，W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上，如果各組份含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔板數比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更容易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數。（一般HPLC柱的N在1000以上。）
若用調整保留時間（tR’）計算理論塔板數，所得值稱為有效理論塔板數（N有效或Neff）=16(tR’/W)2
⊕理論塔板高度（theortical plate height,H）每單位柱長的方差。H=。實際應用時往往用柱長L和理論塔板數計算：H=L/N

4.相平衡參數（distribution coefficient,K）--在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的濃度之比。K=[xs]/[xm] 
Cs-溶質在固定相中的濃度
Cm－溶劑在流動相中的濃度
分配系數與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。在不同的色譜分離機制中，K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數，離子交換色譜法為選擇性系數（或稱交換系數），凝膠色譜法為滲透參數。但一般情況可用分配系數來表示。
在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs 、Cm很小）時，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減少，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質濃度的增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能較少進樣量，使組份在柱內濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。
在同一色譜條件下，樣品中K值大的組份在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組份則滯留時間短，先流出色譜柱。混合物中各組份的分配系數相差越大，越容易分離，因此，混合物中各組份的分配系數不同是色譜分離的前提。
在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及PH值，以獲得組分間的分配系數差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。
⊕容量因子（capacity factor,K）--化合物在兩相間達到平衡時，在固定相與流動相中的量之比。K＝（tR-t0）/t0=tR’/t0（或溶質在固定相中的量/溶質在流動相中的量）。因此，容量因子也稱質量分配系數。
｛K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K＊Vs/Vm Vs：色譜柱中固定相的體積； Vm：色譜柱中流動相的體積。｝
分配系數、容量因子與保留時間之間有如下關系：k===K=,tR’=kt0。上式說明容量因子的物理意義：表示一個組份在固定相中停留的時間（tR’）是不保留組分保留時間（t0）的幾倍。k=0時，化合物全部存在與流動相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長。
容量因子與分配系數的不同點是：K取決于組分、流動相、固定相的性質及溫度，而與體積Vs、Vm無關；k除了與性質及溫度有關外，還與Vs、Vm有關。由于tR’、t0較Vs、Vm易于測定，所以容量因子比分配系數應用更廣泛。
⊕選擇性因子（selectivity factor,α）--相鄰兩組份的分配系數或容量因子之比。α＝＝（設k2>k1）。因k=tR’/t0,則α＝k2/k1，所以α又稱為相對保留時間（《美國藥典》）。
要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質、柱溫有關，與柱尺寸、流速、填充情況無關。從本質上來說，α的大小表示兩組份在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。

5.分離參數
⊕分離度（resolution,R）--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。R=（tR2-tR1）