蛋白質檢測和定量方法

發布時間：2020-04-20 21:37 原文鏈接：蛋白質檢測和定量方法

蛋白質定量方法最早出現在20世紀50年代早期，當時物理學家和化學家進入生物學領域，并將他們的技術應用于蛋白質的分析和測量。 Lowry蛋白質分析是第一個確定溶液中蛋白質總水平的生化分析。不久之后，該測定通過其他測量方法引入，包括紫外（UV）系統和氨基酸分析。所有這些方法都能夠表征水中的蛋白質或非常溫和的緩沖溶液。

隨著蛋白質研究變得更加復雜，定量方法開始發展。 1976年，布拉德福德分析是在天然溶液中研究更多蛋白質并使用清潔劑或其他還原劑來保持蛋白質可溶性的墊腳石。然后將Lowry試驗再培養至二辛可寧酸（BCA）測定（也稱為Smith測定），這使其更適合用于蛋白質研究的溶劑中。

然而，蛋白質定量的最新創新已存在超過25年。小編將概述當前的蛋白質檢測和定量方法，并討論一種新的基于紅外的技術，用于快速準確地測量痕量蛋白質。

當前現狀

用于蛋白質和/或肽測定的一些最常用的方法包括氨基酸分析，紫外（UV）光譜，比色測定，十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和光密度測定，基于免疫學的方法和質譜法。

氨基酸分析

氨基酸分析測量蛋白質中每種氨基酸的量，并被認為是蛋白質定量的黃金標準方法。該方法可以檢測大多數氨基酸，檢測范圍為1 mg苯基硫代氨基甲酰基（PTC）和5 mg至10 mg茚三酮。該方法不像其他測定那樣廣泛使用，因為它昂貴，緩慢且需要技術專業知識。因此，氨基酸分析實驗室經常被用作核心設施。

紫外光譜法

紫外光譜法測量樣品中芳香族氨基酸的吸光度，是用于蛋白質檢測和定量的最常用方法。可以測量任何類型的蛋白質，范圍從205nm處的1mg至100mg和280nm處的20mg至1,000mg。紫外分光光度計相對便宜且易于使用。

比色分析法

通過顯色試劑測定蛋白質濃度的比色測定。最常見的比色測定是染料結合和熒光方法。熒光方法包括NanoOrange試劑盒（在570nm處10ng至10mg）和CBQCA（在550nm處10ng至150mg），其通常比染料結合方法更敏感，包括Bradford（1mg至50mg）和Bicinchoninic。。酸（BCA； 0.2）。鎂至50毫克）。

大多數蛋白質測定對溶劑條件敏感。有關套件和緩沖組件的更多信息，請訪問制造商的網站。該信息使研究人員能夠使用蛋白質沉淀或小規模凝膠過濾去除潛在的干擾物質。

SDS-PAGE和密度測定法

SDS是一種陰離子洗滌劑，可使蛋白質線性化并用負電荷覆蓋它們。然后在電泳期間通過大小分離蛋白質，并且可以使用定量光密度測定法測量蛋白質。對于銀染色，SDS-PAGE蛋白質測定范圍為每條1ng至5ng，對于考馬斯藍，SDS-PAGE蛋白質測定范圍為每條40ng至50ng。

基于免疫學的方法

例如定量酶聯免疫吸附測定（ELISA），Western印跡和斑點印跡，是用于蛋白質檢測和測量的非常常見且靈敏的測定，其依賴于使用抗體進行蛋白質捕獲。這些方法中使用的抗體針對構象和線性表位。對于蛋白質印跡，重要的是使用針對肽或變性蛋白質產生的抗體，因為SDS使抗原變性。

質譜法

質譜法通常用于功能蛋白質組學，以測量復雜生物系統中蛋白質豐度的微小變化，以響應疾病進展或藥物治療等干擾。然而，質譜法可能昂貴且緩慢，并且需要專業知識來運行儀器。此外，質譜儀可能無法完全量化。

新穎的檢測方法

EMD Millipore提供基于直接檢測傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀的新蛋白質/肽定量方法。該系統能夠對蛋白質鏈中的酰胺鍵進行高精度紅外（IR）測量，而不依賴于氨基酸組成，染料結合特性或氧化還原電位。

蛋白質在IR光譜中由9個酰胺峰表示，并代表肽鍵的不同振動模式。特別是，酰胺I和酰胺II鍵的獨特之處在于即使在復雜的混合物，還原劑和洗滌劑存在下它們的信號強度和純度也是相同的。因此，這些頻帶用于測量。該系統的準確性與氨基酸分析的準確性相當直接檢測系統包括蛋白質檢測技術和分析工具，包括預先安裝在軟件上的BSA標準曲線。該測定僅需要2微升樣品，沉積在無測定卡上，置于儀器中然后測量。整個過程大約需要兩到三分鐘。

蛋白質檢測和定量是藥物開發過程的關鍵組成部分。有多種方法可供選擇，每種方法都有自己的優勢和挑戰，并且在為每種應用選擇最佳方法時需要考慮許多因素。

蛋白質定量技術已經使用了半個多世紀，但該領域相對停滯了超過25年。開發新工具對于為研究人員提供快速，易用的蛋白質檢測和定量方法至關重要。