蛋白質常見的四種測定方法一覽

　　1、凱氏定氮法

　　準備4個50mL凱氏燒瓶并標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

　　消化完畢后進行蒸餾，全部蒸餾完畢后用標準鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

　　2、雙縮脲法

　　雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不干擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

　　利用標準蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標準曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，并只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合后于37℃環境中放置10分鐘，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標準曲線上直接查出蛋白質含量。

　　3、酚試劑法

　　取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液，不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

　　4、紫外吸收法

　　大多數蛋白質在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

　　取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

　　5、考馬斯亮藍法

　　Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

　　標準曲線蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品，測定抗體，可用純化的抗體作為標準。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標準曲線。

　　將待測樣本溶于緩沖溶液中，該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉淀，過濾除去。

　　每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合后，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標準曲線計算待測樣本的濃度。