蛋白質免疫印跡實驗

操作流程

(1)制備與凝膠大小一致的硝酸纖維素膜一張，吸水濾紙 2 張 (Whatman 3 MM)。

(2) 將凝膠在轉印緩沖液中浸泡 30m in，將轉移膜、濾紙和海綿墊也在同樣的緩沖液浸濕。

(3) 安裝轉印「夾心三明治」。將凝膠放置在玻璃平板上，然后將一張浸濕的濾紙放在凝膠上，如果是米用半干轉的方式進行蛋白質轉印，那么宜用三張濾紙。將玻璃板翻轉 ，并且將其放置在海綿墊上，用一個小的刮鏟，輕輕地將凝膠和濾紙從玻璃板上分開。然后將轉印膜放置在凝膠之上，用一個圓筒狀的物品，如鉛筆或者玻璃棒放在膜上，輕輕地去除所有的氣泡，然后將第二層濾紙放在轉移膜上并且去除所有的氣泡，如果采用半干轉的方式進行蛋白質轉印，那么這里也應該使用三張濾紙。需要加以注意的是，如果有氣泡存在于凝膠和轉印膜之間，那么將會影響蛋白質轉印的效果。

(4) 將完整的轉印「三明治」放置在轉移夾中，然后將其放入轉印槽中，將轉印膜放置在靠近正極的一面（紅色），而凝膠放置在負極的—面（黑色）。

(5) 電轉印槽的準備。將預冷的緩沖液倒人轉印槽中，如果有必要，可以設置一個緩沖液冷卻系統。如果 采 用 Hoefe r 系統，那么至少需要 4L 緩沖液。轉印緩沖液至少可以使 用 3 次 。但是，由于在轉移的過程中，緩沖液會有所蒸發，因此在重新使用前，可能有必要補充一些新的緩沖液。對半干 轉 印 而 言 ，緩 沖 液 附 著 于 濾 紙 上 ，轉印完成之后棄去即可。

(6) 電轉印時間。在 4°C ，90V 恒壓的條件下轉印 4 h , 或 者 恒 壓 30V ，轉 印 12 h ，在轉印的過程中，需要用一個磁力攪拌器持續攪動緩沖液。在這兩種條件之間，也可以使用其他的轉印電壓和時間，只要保持電壓乘以時間的值為 36 〇即可。半干轉移: 用 400m A 的穩定電流在室溫下（約 23。 0 轉 移 1?2 h 。轉移時間應該根據你的目的蛋白進行優化。轉移過程中電壓會有所變動，但 應 該 為 I 0?2 〇 v 。

(7) 轉印完成后，分開凝膠和膜。將凝膠放入考馬斯亮藍溶液中，將轉印膜放置在另一個容器中，蛋白質面朝上。將 50mi 的麗春紅 s 染色液加在轉印膜之上，孵 育 1?2 min，孵育過程中，輕輕地攪動染液。麗春紅染液可以多次重復使用。

(8) 用水輕輕洗滌以去除膜上多余的背景染料。

(9) 在膜上，用鉛筆將蛋白質標準品相對分子質量的位置標記出來。

(10) 將染色的轉印膜拍照留存。

(11) 繼續洗滌轉印膜直到所有的染料被去除干凈。如果在蛋白質富集的位置，染料仍有存留，那么可以用 NaKPS + Tween 2 0 洗 漆 轉印膜 1?2 min，然后用水浸洗幾次，每次 1?2 min

12.E C L 底 物
按 照 說 明 書 將 檢 測 試 劑 1 和 檢 測 試 劑 2 等 量 混 合 。（E C L W e ste rn blottin g reag e n ts, A m ersh a m B io scien ce/G E H ealthcare Life Sciences) 〇
試劑配制后，如果保存于 4°C ，底物液可以在 48 h 內重復使用。

實驗假象以及故障的診斷和排除

在任何實驗的操作和解釋過程中，都可能有實驗假象的出現，免疫印跡實驗也不例外 。在應用增強化學發光檢測系統與蛋白質 A 聯合運用時，我們不時地看到的一些虛假的 、不一致的信號，這些是需要被排除的，因為它們不是代表特異性的蛋白質條帶。這些信號偶爾會阻礙真實蛋白質信號的顯現。我們推測這些信號可能是由于靜電釋放、凝膠和轉印膜之間存在的氣泡，或者是轉印膜制造過程中本身的缺陷。

另外一個比較重要的問題是蛋白質條帶的扭曲變形，這種情況常常發生在凝膠過程中上樣「過渡」。例如，我們發現，當我們用含有牛血清的細胞培養上清進行電泳時，樣本中血清白蛋白的含量會超過 1 % ?2 % ，如果我們的目的蛋白相對分子質量與白蛋白相對分子質量相近時，它就會導致我們的目的蛋白質條帶扭曲變形，給我們的目的蛋白的識別帶來困難。如果可能，最好避免上樣的待測樣品中含有超過 2 % 的血清白蛋白。

一抗或者二抗與其他蛋白質或膜的非特異性或低親和力的結合也可以導致背景信號的產生。封閉試劑也可能是一抗或二抗的非特異性靶蛋白。例 如 ，當應用蛋白質 A 作為第二檢測分子的時候，用牛奶作為封閉試劑會導致背景信號的增強，這是由于牛奶中含有的 Ig G 2 能較弱地和蛋白質 A 結合 。

當檢測分子直接和酶偶聯的時候, 如和堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶偶聯，必須注意蛋白質印跡膜上是否有內源性的酶活性的存在。例 如 ，來源于兔胃黏膜的樣本過氧化物酶能夠在 SDS-P A G E 的分離過程中保存下來，從而在對膜進行化學發光底物反應時產生相應的信號 [55]。這種酶活性能夠在抗體孵育前用 3 % H 20 2 對膜進行處理來消除。在使用鏈親和素-生物素作為檢測系統的實驗中，內源性的生物素化蛋白質能夠導致非特異性信號的產生。 V a ita itis 等 [66] 在研究細胞核提取物轉錄因子 NF-kB 的實驗中，只將蛋白質印跡膜和鏈親和素-辣根過氧化物酶進行孵育，然后用化學發光底物進行反應，也發現了4 個條帶。為了解決這個問題，首 先 用 0 ?25 g/m l 的鏈親和素對內源性生物素進行封閉處理 ，然后用含 50ng/m l 的 d-生物素（d-biotin) 溶液清洗，以封閉結合在膜上的鏈親和素。這 樣 ，用生物素化的二抗和鏈親和素-辣根過氧化物酶系統就只會識別 NF-kB 。