細胞增殖檢測

血細胞 淋巴細胞

RPMI-1640 細胞培養液 2-巰基乙醇 青霉素 鏈霉素 刀豆蛋白A Hank's液 PBS緩沖液 3H-TdR

篩網 96孔培養板 手術器械 二氧化碳培養箱 超凈工作臺 液體閃爍儀 多頭細胞取集器 49型玻璃纖維濾紙

1. 外周血單個核細胞的采集

（1） 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞 80 - 100ml；

（2） 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞（PBMC）。

（3） 無血清培養液洗滌 2 次，獲得純度在 90%以上的 PBMC，細胞數量需達到 1-3 x10⁸

2. 腫瘤抗原的制備

（1） 手術切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

（2） 無菌生理鹽水洗 3 次；

（3） 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養基，充分研磨；

（4） 200 目無菌網過濾后收集單細胞懸液；

（5）用 RPMI 1640 培養基重懸細胞至 1-2 x10⁷/ml，裝入 5ml 無菌凍存管中；

（6）將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37℃ 水浴中解凍 10 min。反復 3-5 次；（注：也可以-80℃/37℃ 反復凍融 3-5 次。）

（7） 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心 10min；

（8） 收集上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；

（9） -80℃保存備用。

3. DC細胞的培養

（1）步驟 1 中獲得的 PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至 2 x10⁶/ml，置于培養瓶內；

（2）37℃，5% CO2 培養箱中孵育 2h，以使單核細胞貼壁；

（3）洗去懸浮細胞，在貼壁細胞中加入含重組人 GM-CSF（500-1,000U/ml）和重組人 IL-4（500U/ml）的無血清培養液，37℃，5%CO₂培養箱中培養，誘導單核細胞向 DC 細胞分化；

（4） 每 2-3d 半量換液一次，并補足細胞因子；

（5）（可選步驟） 在培養的第 5d， 加入步驟 2 中獲得的腫瘤抗原 50 μg/ml，對 DC 進行抗原負載；（注：若不對 DC 進行抗原負載，該步省略。）

（6）在培養的第 6d，加入重組人 TNF-α（10ng/ml），IL-1β（10ng/ml），IL-6（1000U/ml）和PGE2（1μg/ml），誘導 DC 細胞成熟；

（7） 在培養的第 7d 或第 8d，收獲 DC 細胞，其數量應達到 1×10⁶個以上；

（8）DC 的質檢：

① 活細胞比例：臺盼藍染色驗證活細胞應在 90%以上；

② 形態學觀察：>90%細胞半懸浮，細胞有多個樹突樣突起；

1. DC來源廣泛，對實驗的結果影響很大，來源包括，外周血單核細胞（Monocyte）、臍帶血 CD34+細胞、骨髓和胎肝等，但因外周血單核細胞最容易獲取、數量也最多，所以臨床上被廣泛用作 DC 的來源細胞。

2. DC 的成熟度兩種，即 iDC 和 mDC，而 DC 的抗原遞呈能力與其成熟狀態密切相關。iDC 的抗原攝取和加工能力較強，但抗原遞呈能力很弱。在體外培養時，iDC 去除細胞因子（即 GM-CSF 和 IL-4）后，會逆轉為巨噬細胞，且即使在細胞因子的維持下，未成熟 DC 的功能也不是激活 T 細胞，而是抑制 T 細胞的增殖。mDC 則正好相反，其抗原攝取和加工能力很弱，但具有很強的抗原遞呈能力。因而可以激活 T 細胞，引起免疫反應。而且 DC 成熟后即使在培養體系中去除細胞因子，仍能保持 DC 的狀態和功能，不會發生逆轉。因此可以看出，DC 必須完全成熟后才能用于免疫治療。

3.樹突細胞的觀察：樹突細胞的觀察需要借助透射電鏡，透射電鏡可見DCs伸展的突起，掃描電鏡還可以拍攝到DC正在捕捉凋亡小體。

1. 從 DC 的祖細胞（如單核細胞）誘導分化為未成熟 DC：IL-4 在由單核細胞誘導成 DC 的過程中發揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導單核細胞向 DC 方向分化。 若培養體系中不加 IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4 還有降低細胞表面表達 CD14 分子的能力。CD14 表達水平的降低是單核細胞分化為 DC 的重要標志。

2. 從 iDC 誘導分化為成熟 DC ：TNF- ，IL-1 和 IL-6 均為促炎癥因子，在感染局部和腫瘤部位被誘導產生。體外研究表明，這 3 種細胞因子均可下調未成熟 DC 的巨胞飲作用和表面 Fc 受體的表達，使細胞內 MHC II 類分子區室（class II compartment）消失，但能夠上調細胞表面 MHC I類、II 類分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等）的表達， 使未成熟 DC 分化為成熟 DC，此時 DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強地激活 T細胞。TNF- IL-1 IL-6 三因子組合可在無牛血清培養條件下誘導 DC 的完全成熟，從而制備出可以應用于臨床的 DC。

3. 樹突細胞的提呈抗原的方法主要有①抗原多肽刺激的DCs②酸提抗原刺激的DCs③腫瘤抗原編碼基因導入DCs④腫瘤mRNA刺激的DCs⑤細胞因子基因修飾DCs及其與腫瘤細胞融合。