等電聚焦和二維凝膠電泳實驗（三）

二、方法

蛋白質樣品制備

穩定的樣品制備對于任何成功的生物分析性測定都是至關重要的。為了增加實驗的重復性, 并將預期外的變異降至最小，使用的緩沖液和材料都應該是質量最好的，并且在采購時需特別小心。應該使用小分子蛋白酶和磷酸酶抑制劑，如抑肽酶 (aprotinin)、亮抑肽酶 (Ieupeptin)、胃蛋白酶抑制劑 (pepstatinA)、木瓜蛋白酶抑制劑 (antipain)、4-(2-氨乙基) 苯磺酰氟 (AEBSF)、鉺酸鈉（sodiumorthovanadate)、岡田酸（okadaicacid) 及微囊藻素 (microcystin) 等 (或采用這些小分子抑制劑的商品化試劑盒）。值得注意的是，不要采用會在二維凝膠中溶解的抑制劑 (如大豆胰蛋白酶抑制劑)①。

(1) 只要樣品隨后會沉淀以移除非蛋白質離子組分 (可嚴重干擾等電聚焦的成分, 詳見本章 3.2 節）, 則基本上可以使用任何一種蛋白質提取緩沖液。隨后用一種與二維凝膠相兼容的緩沖液重懸樣品。在許多情況下蛋白質提取物無需沉淀，直接在這種緩沖液中制備和分析。不用將額外的離子化合物加入到樣品中，下述緩沖液已含有充分的高離液活^性（chaotropicactivity)。

①標準二維凝膠電泳裂解緩沖液 (RabiUoucUl 卯 8):7mol/L 尿素、2mol/L 硫脲、4%CHAPS、2 mg/mLDTT 及 50 mmoVLpH8.0 的 Tris-HCU

②用于膜相關蛋白質時有所調整：7mol/L 尿素、2md/L 硫脲、2% 脒基磺基甜菜喊-14 及 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl。緩沖液系統包含其他鹽和去污劑，尤其是十二烷基磺酸鈉，可更有效地提取蛋白質，但必須在進行等電聚焦前先沉淀。

③TNE:50 mmol/LpH7.6 的 Tris-HC1、150 mmol/LNaCl、2 mmol/LpH8.0 的 EDTA、2 mmol/LDTT 及 l^WNP-40。

④RIPA 緩沖液：50 mmol/LpH8.0 的 Tris-HCl、150 mmol/LNaCl，l%NP-40、0.5% 脫氧膽酸及 0.1%SDS。

(2) 迅速重懸細胞以抑制蛋白酶解活性是至關重要的。將提取物 15000 g 或 100000 g 離心 10 min，除去可干擾等電聚焦的不溶性蛋白質和磷脂。

(3) 某些情況下，超聲可斷裂核酸使其在隨后的凈化步驟中與磷脂一同被除去，從而提高樣品質量。核酸和磷脂這兩種非蛋白質類陰離子組分都會干擾等電聚焦 (詳見本章 3.2 節）。建議將樣品放置冰上，并使用超聲儀尖端探頭進行短脈沖處理。

(4) 在所有的步驟中，使體系保持冷環境是很重要的, 尤其是含有尿素的樣品絕不能被加熱。尿素過熱 (超過 37°C) 會加速異氰酸鹽 (一種尿素的自然分解產物）的形成，反過來將使自由氨基甲酰化。當該反應發生在蛋白質上時 (發生在氨基末端的殘基上或在賴氨酸殘基的 e-氨基上），會阻止這些位點的質子化，引起等電點的酸性漂移。二維凝膠電泳中大量樣品氨基甲酰化造成的結果是漂亮的蛋白質斑點串，看起來好像是翻譯后修飾，但卻完全是偽跡。

(5) 測量蛋白質濃度可采用各種標準方法。需注意要采用與蛋白質提取緩沖液相兼容的方法。例如，CHAPS 和硫脲（盡管完全適合于蛋白質提取）將會干擾 Bradford 或 BCA 實驗，導致數據錯誤和不可靠。遇到這些情況時，應該在定量前沉淀分裝出來的小份樣品，再重溶于適當的緩沖液中，或采用與定量實驗相兼容的去污劑。

(6) 對于細胞培養實驗，蛋白質濃度可由細胞數目估算得出。例如，對于由 697 前-B 淋巴瘤細胞株制備得到的蛋白質樣品（可從德國微生物菌種保藏中心獲得，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZNo:ACC12)，IO7 個細胞約對應 Img 蛋白質提取物。為了移除生長培養基組分 (尤其是血清蛋白質），在收集細胞前必須要徹底地清洗細胞 (至少用 PBS 清洗 2 次)。需用細的移液器 tip 頭將最終的細胞沉淀中所有的 PBS 小心吸去。細胞沉淀 (通常每管 IO8 個細胞) 保存在一 8 0°C。

(7) 細胞提取物此時可以用于脫水的梯度膠條，可以通過膠內再水化或是杯上樣完成。在加人樣品前，應該加人適當的兩性電解質或是 IPG 緩沖液，大多數只需 0.5%(V/V)(但如果需要的話增量到 2% 也可以接受）。如果樣品緩沖液中沒有溴酚藍，加入少量 (可加入干固體的少許晶粒, 或者幾微升溴酚藍水溶液) 以作為等電聚焦的失蹤染料，同時也作為杯上樣過程中的視覺輔助。或者，樣品可無期限地先保存在一 8 0°C。

樣品凈化與沉淀

正如前述，有時非蛋白質離子 (如鹽、磷脂) 的存在會降低 IPG 膠條的電阻, 干擾等電聚焦，因此在不使膠條過熱的情況下難以獲得需要的高電壓以進行高分辨率聚焦。由于大部分商品化的等電聚焦儀器都將許多膠條集合在并聯電路上，其中一個膠條出現電阻顯著性差異將會對其他膠條分離造成不利影響。

通常一 欠凈化或沉淀步驟可以移除這些干擾離子，或者至少使所有樣品標準化至具有相似電阻。沉淀不僅可以同時移除多種污染物，而且還能有效瓦解復合物和不可逆地抑制蛋白酶活性。最有效的沉淀方法是使用甲醇和三氯甲烷 [根據 Wessel 和 Flugge(1984)] 或使用三氯乙酸、脫氧膽酸鹽和丙酮 [根據 Arnold 和 UlbriCh-H o fmann(1999)]。

在等電聚焦前，蛋白質必須在增溶液中再溶解 (詳見本章 3.1 節）。此外，一些用于蛋白質二維凝膠分析的沉淀試劑盒也可從一些商業渠道獲得。Wessel 和 Flugge(1984) 方法的改編版描述如下。

(1) 將預定量的蛋白質提取物用水補足體積至 1 00 pL。

(2) 加人 3 0 0 水 (3 倍體積）。

(3) 加人 400 甲醇 (4 倍體積)。

(4) 加人 100fiL 氯仿 (1 倍體積)。

(5) 劇烈渦漩振蕩并離心。蛋白質沉淀物將出現在分界面上。

(6) 將水/甲醇混合物從分界面頂端去除，小心不要擾動分界面。沉淀的蛋白質通常不會形成一個可見的白色分界面，因此注意不要破壞分界面。

(7) 再次加人 400 甲醇以清洗沉淀。

(8) 劇烈渦漩振蕩并離心。蛋白質沉淀物便沉積于試管底部。

(9) 去除上層清液，并用真空離心機將蛋白質沉淀簡單地干燥。

(10) 在適量的可兼容二維凝膠的緩沖液中重懸這些蛋白質沉淀 (詳見本章 3.1 節）。

當用沉淀法作為凈化步驟時，建議蛋白質起始濃度為 1~1 0 mg/mL。如果蛋白質樣本過稀，在清除沉淀后將很難定量地回收蛋白質。凍/融也應控制在最少量，通常 ImL 分裝量或更少的冷凍樣本就已足夠。對于 DIGE 實驗而言，沉淀步驟極大地滿足了標記樣本在不含游離氨且酸堿平衡的二維凝膠電泳樣本緩沖液的需求。

使用酸性范圍的 IPG 肢進行等電聚焦

大多數商品化的等電聚焦儀器每次電泳時都能夠裝載至多 12 條獨立的 IPG 膠條。

重要的一點是，要將同一次電泳中待測的每根 IPG 膠條都盡可能保持同一水平，因為在大多數配置中，單個的 IPG 膠條會在正電極和負電極之間形成一個并聯電路。任何 IPG 膠條若在組分中 (特別是在離子成分方面) 異于其他膠條，便會影響到所有膠條的分辨率，有時這種消極影響是巨大的。因此，強烈建議只同時聚焦同一 PH 梯度的相同長度的 IPG 膠條，所用的樣品也要來源于同一實驗（如樣本類型和組分要盡可能相同)①。

以下方法用于 24 cm,pH4~7 的 IPG 膠條。

(1) 將 IPG 膠條在含有蛋白質總量高達 0.5~2 mg 的二維凝膠樣品緩沖液中再水化 (詳見本章 3.1 節），對于每根 24 cm 的膠條，需要在再溶脹托盤中將蛋白質樣品稀釋或重懸至終體積 450uL。用 2~3 mL 的石蠟油覆蓋膠條防止尿素結晶。

(2) 加人樣品的膠條的再水化過程至少要經過 12 h, 但更建議在室溫下進行一夜。一些蛋白質，特別是高分子質量蛋白質需要更長的時間才能在再水化過程中進入膠條內。

(3) 在完全再水化后, 將膠條移人水平電泳系統, 并將此系統的冷卻塊溫度恒定于 20°C。

(4) 將潮濕的吸干紙鋪于再水化的 IPG 膠條兩端，電極放置到位，并把石蠟油覆蓋在膠條之上&。

(5) 表 30.1 為典型的聚焦方案。