神經細胞培養基質的預處理實驗

幾乎所有神經細胞的培養必須有大分子物質作為生長基質 ，細胞黏附其上才能生長 。 常用的有多聚賴氨酸 (polylysine ) 和多聚鳥氨酸 ( polyornithine) 。 此外還有 一些 細胞外 基質 ( ECM) 成分，如層黏連蛋白 (laminin) 、纖連蛋白 (fibronectin) 、膠原(collagen ) 等 。

神經細胞

培養液

培養瓶 恒溫箱

1.多聚賴氨酸和多聚鳥氨酸；

多聚賴氨酸和多聚鳥氨酸是兩種最常用的促進細胞貼壁生長的大分子。Polylysine或polyornithine均可從各種試劑公司訂購，我室常用的是Poly-L-lysine hydrobromide (SigmaP6282),用pH值8.4的硼酸緩沖液或pH值7.4的PBS配成100μg/ml,過濾分裝，-20℃保存。包被培養板時，我們一般選用25μg/ml的濃度進行包被，37℃4h或過夜，然后無菌水洗3遍（一定要將未結合的大分子洗去，因為他們都有細胞毒性），超凈臺中晾干。包被好的培養板和細胞瓶可在4℃保存2-4周，多聚賴氨酸可回收重復使用1-2次。

2.細胞外基質成分(ECMcomponents):

??????????????????????????????????????細胞外基質成分是體內細胞間粘連和接觸的最重要的參與物質，細胞外基質成分與細胞表面受體結合不僅調節細胞黏附，還直接調節細胞代謝、分化和基因表達。適用于在神經元培養尤其是外周神經系統神經元的培養。

膠原是動物體內最為豐富的蛋白，Ⅰ型纖維膠原很早就用于神經系統的組織培養，現在在外周神經系統的神經元和神經系統細胞系的培養中依然很常用 。Ⅰ型纖維膠原可以自己從鼠尾提取，現在也有很多商品化的產品可以購買 。 膠原包被時只需用很少最的溶液覆蓋培養基質，放置于超凈臺中讓水分自然揮發，自然凝固即可 。

纖連蛋白和層黏連蛋白是膠原之后另兩種被用于神經細胞體外培養的兩種細胞外基質成分 。 不同類型細胞對兩種蛋白的敏感度不同，神經元大都在層黏連蛋白包被的基質上生長得更好 。 包被濃度為 10μg/ml 的層黏連蛋白 (Sigma L2020) 和 20μ,g/ml 的纖連蛋白 (Sigma F0635) 。

3. 神經干細胞的貼壁生長

神經干細胞 一般呈球形懸浮生長，如要貼壁培養，可預先采用 0 . 001 %多聚鳥氨酸和 0. 2% 明膠包被新的培養瓶，鳥氨酸包被過夜，明膠包被 4 -5h, 用時將明膠吸出，將神經球加進去，第 2天就可以觀察到成球生長的神經于細胞已經單層生長 。

1.配置試劑的水質要有保證，最好使用超純水，配液要精準。有條件的可以選擇商品化的已配置好的試劑。

2.所有器皿、器械要潔凈、干燥、無菌。不要用洗潔精清洗所用器皿，而且所有玻璃器皿都要過酸。我室現在使用一種新型清潔劑“迪康90",可生物遞減分解，完全可清洗且不易燃燒，代替了銘酸混合清潔劑，保證工作人員的安全。

3.在無血清培養基中添加抗生素時，應至少降低有血清培養基中所使用濃度的50%。因為血清蛋白會結合和滅活一些抗生素，無血清培養條件下，抗生素不被滅活，濃度過高可能對細胞起到毒性水平。

4使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮其神經元毒性，應該確定最低效應的使用濃度。如阿糖胞苷在很低的濃度下，也會對某些種類的神經元有毒性，可以造成特定神經元的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現出這種毒性。

5.添加物和試劑不可反復凍融，尤其是含蛋白的試劑。如果凍融次數過多將會影響其生物活性。

6.配制消化酶溶液時應注意使用適當的溶液（不含Ca²⁺、Mg²⁺),調節至合適的酸堿度。用酶消化法解離細胞總的來說對細胞的損害程度較之機械分散法為輕，尤其是對于分化程度較高、形態不規整的細胞（如成年動物神經組織細胞）更如此。但是，用胰蛋白酶溶液過度消化細胞也會對細胞造成較大傷害。因此，必須注意控制酶植（酶濃度）、作用時間長短以及酶處理溫度。

培養神經細胞實驗心得：

1.選擇培養基是細胞培養的基礎和重要工作。這可以查閱參考文獻，或在購買細胞株時咨詢。本實驗室常用的培養基不妨一試，許多培養基可以適合于多種細胞。

2到底使用哪一種消化酶溶液，要根據擬解離組織的細胞外間質的具體構成成分而定。另外，在實際操作過程中，常會因組織的不同而需要聯合使用幾種消化酶。譬如，胰蛋白酶溶液與膠原酶溶液交替使用，膠原酶溶液與透明質酸酶聯合使用等。更多情況下是將酶消化法與機械分離法結合使用以解離細胞。

3.自己清洗爬片時，最好將爬片放在大的平皿中，置于水平搖床上清洗，這樣才能保證清洗干凈。

4.在很多神經元的原代培養中，可使用聯合包被的方法，多聚賴氨酸或多聚鳥氨酸包被之后，再用層黏連蛋白或其他細胞外基質成分包被以達到最佳效果，大分子物質可促進細胞外基質成分同培養板的結合。

5.各種包被試劑的濃度、作用時間都有很多不同說法。不同實驗室的體系不同，還需要實驗人員自己摸索。雖然包被過的培養板可以在4°C保存一段時間，但培養一些比較特殊的神經元時最好還是現用現包