研究揭示高切割活性的IID型Cas9的結構與機制

　　中國科學院生物物理研究所王艷麗團隊揭示了一種高切割活性的II-D型Cas9的結構與機制，為小分子量基因編輯工具的開發提供新思路。相關論文近日發表于《自然-通訊》

　　CRISPR-Cas系統是廣泛存在于細菌和古菌的RNA引導適應性免疫系統，其中Cas9是II型系統的標志性蛋白，通過HNH和RuvC兩個核酸酶結構域與crRNA及tracrRNA或單鏈sgRNA結合，實現靶向雙鏈DNA切割。目前應用最廣泛的SpCas9雖然切割效率高，但其分子量較大，限制了腺相關病毒（AAV）遞送。因此，尋找更小且高活性的Cas9蛋白成為基因編輯領域的重要目標。

　　研究團隊在宏基因組數據中鑒定出來源于硝化螺旋菌的II-D型Cas9——NsCas9d，僅由762個氨基酸組成，較常見的II-A/B/C型Cas9更為緊湊。通過體外切割實驗發現，NsCas9d在與sgRNA形成至少20個堿基配對后，可實現與SpCas9相當的雙鏈DNA切割活性。PAM識別實驗顯示，NsCas9d識別5′-NRG-3′ PAM序列，其中5′-NGG-3′可實現最高切割效率。

　　團隊解析了NsCas9d-sgRNA-dsDNA三元復合物的2.86 ?冷凍電鏡結構，首次完整呈現II-D型Cas9的HNH和RuvC結構域。結構顯示，HNH催化中心正對切割位點，表明蛋白處于活性狀態；PAM序列位于PI和WED結構域形成的正電結合通道內。切割產物為帶3-nt 5′粘性末端的DNA，與典型Cas9產生平末端不同，這一特性有助于基因插入等操作中提高DNA修復效率。

　　在HEK293T細胞實驗中，NsCas9d可成功靶向目的序列，實現基因編輯，但效率低于SpCas9。研究人員指出，通過結構優化和技術改進，有望提升NsCas9d的體內編輯效率，從而滿足對小分子量、高活性Cas9的應用需求。

　　該研究得到了國家重點研發計劃、北京市科學技術委員會、國家自然科學基金、北京市自然科學基金、中國科學院的項目資助。生物物理所生物成像中心為電鏡數據收集提供了技術支持。

　　相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41467-025-62128-8