用PCR進行基因分型

與許多一次做數百塊Southern blots的研究人員一樣，我第一次用PCR做基因分型（genotyping）時覺得見效很快，不再需要等幾天才能看到結果，不再需要DNA顯微圖像或者操作紫外線了。隨著技術的不斷進步，RCR使基因組學和轉錄組學發生了翻天覆地的變化，甚至隨著免疫PCR的普及開始進軍蛋白組學。

目前有許多以RNA為基礎的基因分型技術，有些只是名稱不同，簡單到只是跑塊膠，有些很復雜，需要檢測單核苷酸多態性的累積。選擇哪種方法當然依據需要而定，但這里對某些以PCR為基礎的基因分型分析的優點和缺點做了一個簡要總結。下標列出了一些常見的系統和平臺及其詳細特征。

The Simple Acronyms

最基本的設計是序列特異引物（sequence-specific primers ，SSP ）或稱等位基因特異性引物延伸（allele specific primer extension ，ASPE）、序列特異性寡核苷酸探針（sequence-specific oligonucleotide probes，SSOP）或等位基因特異性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotides ，ASO）、限制性片段長度多態性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。進行低通量研究時，這些分析不需要特異儀器。

一般情況下，SSP中變的異體專一引物所檢測的特異突變或者是positive 或者是negative；在SSOP中，將標記過的擴增子（amplicon）綁定在位于雜交斑點上的變異體專一探針，檢測突變；RFLP中，用限制性內源性降解PCR產物，通過觀察切開或者未切開片段，得到結果。盡管突變的位點對SSP設計引物有限制，但SSOP和RFLP為引物設計帶來了很大彈性，引物可以在任何地點，嘗到甚至可以跨越突變。

我還發現RFLP（又稱擴增片段長度多態性，amplified fragment length polymorphism，AFLP）得到明確結果，鑒別突變有合適和和便宜的核酸內切酶。加入標記過的引物，大多數遺傳分析儀可推算片段長度。問題在于它需要post-PCR操作，意味著污染的風險，而且也不適合高通量研究。

對于大項目，所有三種方法都很昂貴和耗時，但因為大多數自動化方法要求擴增小片段，基本的設計是分析大片段的唯一選擇。而且，有旁向性同源基因（paralogs）的基因需要具有位點特異性的引物。假如目的突變和位點特異的引物相距較遠，基本方法是必需的。

熔解曲線法

DNA的堿基組成影響變性溫度。利用特異熒光染料或者標記探針的高分辨率熔解點分析能夠在PCR（標準設備上）進行5～10分鐘后鑒別一個PNA片段上的寡核苷酸突變，所需的專用設備包括Idaho Technology公司的LightScanner（或HR-1）和羅氏的LightTyper，但某些實時PCR平臺也有這種功能。

該方法還可用于檢測新突變和未知突變，專用設備能夠在短時間內分析384孔平板，使高通量分析成為可能。至少可以區分一個片段的4種熔解溫度，用六種顏色標記探針。因此，至少一次能夠探測24個靶標，因此這種方法很便宜，而且對引物設計沒有要求，系統始終處于封閉的管中，降低了污染風險。一些變異在低分辨率平臺中會丟失，但這種方法有望成為最流行的篩選和檢測突變的方法。

焦磷酸測序（Pyrosequencing）

多種引物延伸和以連接為基礎的化學法已經整合入久經考驗的“allelic discrimination”的高通量分析法中。焦磷酸測序法（Pyrosequencing）是一種新的實時DNA測序技術，以單堿基延伸反應（single base extension，SBE）為基礎，在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，使引物延伸聚合脫氧核糖核酸（dNTP）釋放焦磷酸鹽（PPi）、PPi轉換三磷酸腺苷（ATP）、ATP產生熒光信號與dNTP和ATP的降解等化學反應偶聯起來。dNTP以預定順序被依次加入反應混合物中，如果序列上又添加了一個堿基，會有熒光出現。焦磷酸測序法能夠一次檢測384個樣本，在所有引物延伸反應中，對引物設計有限制。

焦磷酸測序最適合于空間位置較近的多個突變的基因分型，但不適合檢測單個突變，部份原因是實驗程序稍微復雜，而且會增加在酶和試劑上的開銷。然而，對擁有自動genotype-calling能力的小或者中等大小的項目來說是一種恰當的基因分型和微型測序法。

懸浮點陣技術（suspension array technology）

一項液相基因型分析方法和熒光標記的微珠捕獲過程相結合的新技術。在單堿基延伸反應中，5’端有特定標記且3’端有靶特異性的寡核苷酸，與PCR擴增的基因組DNA靶標雜交，然后被DNA聚合酶延伸。核酸探針經過生物素標記，微珠經過抗生素（生物素和抗生素相互作用）標記。然后用血細胞計數工具——Luminex分析儀分析微珠。

每個微珠都是某個單突變的聚集點，如果有突變，便會發射生物素－抗生物素蛋白產生的單色熒光。以珠子為基礎的平臺與單堿基延伸、引物延伸、雜交和寡核苷酸連接反應能夠達到相同的功效。Luminex發明了懸浮點陣技術，能夠進行數百套檢測，因此經過PCR擴增后，能夠在一個孔中對50個二等位基因（biallelic）突變進行基因分型，使其對大量突變特別是HLA或者MICA中的單基因突變研究效果更佳。多路技術降低了分析成本，但優化多元反應也很困難。

質譜法

原則上，添加到引物末端的核苷能夠直接依據質量，利用通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscopy，MALDI-TOFMS）直接檢測出來，這是一種不需標記的方法。單堿基延伸產物質譜結果能夠顯示所添加的核苷。

MALDI-TOFMS需要大型設備，但因為高度多路技術和高通量分析，這種方法的成本只為0.03美元/單突變，只是備的成本限制了其普及。MALDI-TOFMS還能實現利用非常少量的DNA的超高通量分析。最主要的MALDI-TOFMS平臺是Sequenom的MassArray 基因分型系統。

忠告

一次基因分型分析所能夠檢測的遺傳突變的數量正在快速增長，比如能進行全基因組聯合研究的微點隈雜交（Hybridization to microarrays）。雖然實驗過程比較簡單，但對于有多個旁系同源體的基因或相關的假基因，不能簡單地相信自動分析儀或者微列陣得到的結果。研究它們的突變，首先要對這些片段進行選擇性擴增和基因分型，基因的數量無關緊要，而且，單核苷酸多態性只代表了基因組突變的80%。還有要牢記一點：全基因組相關性研究并不是檢測全基因組。