用PCR分析連接反應的底物和產物

ddH2OVent 緩沖液Vent DNA 聚合酶dNTP引物質粒 DNA

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備熱循環儀

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

ddH₂O

2. 酶和酶緩沖液

10X Vent 緩沖液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

引物，可以與合成的 DNA 文庫克隆位點兩側的載體序列退火

質粒 DNA(見下面第 1 步）

4. 特殊設備

瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑和設備，包括溴化乙錠

熱循環儀

二、方法

1.混合以下組分。

10~50ng 的質粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10X Vent 緩沖液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH₂0 定容至 50ul

下面的每種質粒載體，應該分別進行反應：

未消化載體

消化載體，但沒連接

消化載體，并在無文庫 DNA 情況下進行連接

消化載體，并用文庫 DNA 進行連接

2.在一個熱循環儀中，94°C 將混合物預熱 20s。

3.按下面的參數進行 30 輪 PCR 循環。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合適退火溫度）

72°C15s

將最后一個循環的延伸時間延長至 30s

4.冷卻至 4°C

5.取 25ul 的各反應產物，跑 4% 的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色分析（Sam-brook and Russell 2001)。

三、分析

在圖 26-3 所示的例子中，在連接之前進行線性化載體的 PCR 分析，顯示載體是完全線性化的，因為沒有得到起始載體對應的 PCR 產物（圖 26-3, 第 4 泳道）。若不存在文庫插入片段，連接載體的 PCR 結果顯示發生了一定量的自連（圖 26-3, 第 2 泳道），并顯示存在一小部分的單切載體。然而，當載體與文庫插入片段進行連接后，大部分的 DNA 產物與正確連接的文庫 DNA 相對應，而沒有與起始載體對應的 PCR 產物（圖 26-3, 第 3 泳道）。當載體與插入片段連接后，檢測不到起始載體對應的 PCR 產物，但僅用載體連接后能檢測到 (比較圖 26-3 第 2 泳道和第 3 泳道），可以解釋為文庫 DNA 連接到了單切的載體上。這一副產物不會形成封閉的環狀質粒，不能被克隆，也不會產生 PCR 產物。



在這個例子中，PCR 作為一種重要的分析工具，能夠很可靠地驗證限制性酶切反應和連接反應。因此，研究者可以用正確的 DNA 進行文庫構建的后續步驟，更可能最終獲得高質量的文庫。通過轉化和擴增細菌，可以獲得最終的文庫，再用標準的程序對質粒 DNA 進行純化（Sam brook and Russell 2001)。