甘露聚糖酶的酶學性質研究

甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，以內切方式降解β-1，4糖苷鍵，降解產物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。它不僅能夠降解腸道粘度，促進營養物質的消化和吸收，而且還可消除豆類中富含的β-甘露聚糖對葡萄糖吸收的干擾，極大提高餅粕尤其是豆粕的能量消化率；同時，添加了甘露聚糖酶后動物的抵抗力及整齊度都有提高。
甘露聚糖類物質作為半纖維素的第二大組分，廣泛分布于自然界中。它是所有豆科植物細胞壁的主要組成成分，在其他植物性飼料原料中含量也很高，如豆粕、小麥、菜籽粕、麩皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分別為22.7％ ，11.9％ ，19.6％和33.7％。
我國豬、雞的主要日糧是玉米／豆粕型日糧，盡管豬、雞等單胃動物對玉米的消化率較高，但對豆粕的能量利用率僅為50％～60％。單胃動物對豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有22.7％左右的半纖維素是不能被單胃動物消化的非淀粉多糖。飼料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖、降低消化道內容物黏度，破壞植物性飼料細胞壁結構，使營養物質能與消化酶充分接觸，提高內源酶的活性，改善腸道微生物菌群和提高腸粘膜的完整性等功能。
本文旨在通過對康地恩甘露聚糖酶的酶學性質研究，掌握有關數據，為實際應用提供理論依據和指導。
1材料與方法
1.1 材料與試劑　　康地恩甘露聚糖酶；甘露聚糖（Sigma公司）；3,5—二硝基水楊酸（DNS）；甘露糖（Sigma公司）。
1.2 主要實驗儀器　　722型分光光度計；電子分析天平；可調恒溫水浴鍋；精密pH計等。
1.3 酶活力測定
1.3.1酶活測定方法。采用還原糖法（DNS）測定。
1.3.2 酶活力單位定義。在40℃、pH4.5的條件下，每分鐘從甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解釋放1 μg還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。
1.3.3甘露糖標準曲線的繪制。配制10mg/mL的甘露糖溶液100mL，吸取上述溶液分別配制成濃度為0.10~0.70 mg/mL的甘露糖標準溶液。
分別吸取上述濃度系列的甘露糖標準溶液各2.00mL（做二個平行），加入到刻度試管中，再分別加入2.00mL蒸餾水和5.00mL DNS試劑，（標準空白測定則是以2.00mL蒸餾水代替甘露糖標準溶液），電磁振蕩3s，沸水浴加熱5min，然后用自來水冷卻到室溫，再用水定容至25mL。以標準空白樣為對照調零，在540nm處測定吸光度OD值。                                           
以甘露糖濃度為Y軸、OD540為X軸，繪制標準曲線。
1.3.4 酶活力的測定。吸取2.00mL經過適當稀釋的酶液，加入到刻度試管中，預熱2min，再加入2.00mL經過預熱的甘露聚糖溶液，電磁振蕩3s，恒溫反應30min。加入5.00ml DNS試劑，電磁振蕩以終止酶解反應。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25mL，混合均勻。同時采用先加DNS試劑后加甘露聚糖溶液的酶液為空白對照，在540nm處測定吸光度。吸光度控制在0.2～0.4范圍內。
1.4 實驗方法
1.4.1 酶反應的最適pH。配制A ：0.05mol/L的檸檬酸溶液，B：0.1mol/L的磷酸氫二鈉溶液，將A、B兩種溶液按一定比例混合配制pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的緩沖液；以蒸餾水配制0.8％的甘露聚糖溶液，酶樣品用蒸餾水稀釋50倍后再以不同pH的緩沖液作適當稀釋進行酶活測定。以最高酶活為100%,在其他條件的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此pH條件下的相對酶活。
1.4.2 酶反應的最適溫度。調節恒溫水浴鍋，分別設定反應溫度為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,在最適pH緩沖液下測定酶活，以最高酶活為100%,在其他條件的酶活占最高酶活的百分數即為該酶在此溫度條件的相對酶活。
1.4.3 酶的濕熱穩定性。稱取5.0000g左右酶樣品，以對應最適pH的緩沖液定容至50mL，攪拌30min，以4000rpm離心10min，取上清液待用。將兩支盛有9mL最適pH緩沖液的試管分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的水浴鍋中預熱10min，分別加入1.00mL酶液迅速搖勻并準確計時2min、5min，取出后迅速于冰水浴中冷卻后于最適pH和溫度40℃的條件下測定酶活，以未經高溫處理的酶樣酶活為100%,其他條件的酶活占未處理酶樣酶活的百分數為相應條件的相對酶活。
1.4.4酶的pH穩定性（耐酸性）的研究
1.4.4.1稱取1.5000g酶樣加入15mL保護液（2％葡萄糖+2％牛肉膏+2％蛋白胨）在磁力攪拌器上攪拌30min，在最適pH和溫度40℃的條件下測定酶活作為對照。
1.4.4.2稱取1.5000g左右酶樣品十二份，分別加入15mL保護液，攪拌30min，以合適濃度的檸檬酸溶液（0.3mol/L）或氫氧化鈉溶液（3mol/L）調pH分別至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，準確記錄所用檸檬酸或氫氧化鈉溶液的體積Va1~Va12，再用相同濃度的氫氧化鈉溶液或檸檬酸溶液調整pH至該酶的最適pH，同樣記錄所用溶液的體積Vb1~Vb12。
1.4.4.3稱取1.5000g左右酶樣品十二份，分別加入15mL保護液，攪拌30min，于40℃水浴鍋中預熱10min，于磁力攪拌器上邊攪拌邊迅速加入1.4.4.2中記錄體積Va1~Va12的檸檬酸或氫氧化鈉溶液于水浴鍋中保溫（加入檸檬酸或氫氧化鈉溶液即開始計時）2h；結束后，在磁力攪拌器上邊攪拌邊迅速加入1.4.4.2中記錄體積Vb1~Vb12的氫氧化鈉或檸檬酸溶液，在最適pH和溫度40℃的條件下測定酶活，以1.4.4.1所測酶活為100%,其他條件的酶活占對照酶樣酶活的百分數為相應條件的相對酶活。
2 結果與分析

2.1 甘露聚糖酶的最適反應pH
在40℃、不同pH的緩沖液中測定酶活見圖1。
由圖1可以看出，康地恩甘露聚糖酶隨著pH的增加，酶活呈上升趨勢，在pH4.5時達到高峰，然后開始下降，在pH3.0～5.5之間可保持80%以上的酶活。同樣得到另外幾種樣品的最適pH分別為：市場樣A6.5、市場樣B5.5、市場樣C6.5、甲公司07年樣品5.5、甲公司06年樣品6.0、某公司樣品A和樣品B均為5.0。

2.2 甘露聚糖酶的最適反應溫度
調各甘露聚糖酶液pH為其最適反應pH，在不同溫度下測定的酶活變化情況見圖2。
由圖2可以看出，康地恩甘露聚糖酶酶活隨著反應體系溫度的增加呈上升趨勢，到70℃酶活達到最高，溫度超過70℃后酶活開始下降，該酶的最適反應溫度為70℃；同樣由圖可以得到另外幾種樣品的最適反應溫度分別為市場樣A50℃、市場樣B65℃、市場樣C45℃、甲公司07年樣品70℃、甲公司06年樣品50℃、某公司樣品A60℃。

2.3甘露聚糖酶的濕熱穩定性
經不同溫度分別濕熱處理2min及5min后酶活變化曲線如圖3。
由圖可以看出，各甘露聚糖酶在濕熱處理2min及5min后酶活曲線基本具有相同的變化規律。在40℃～60℃康地恩甘露聚糖酶酶活基本無差異。溫度在76℃以下時保持80%以上的酶活。市場樣A隨著溫度升高酶活逐步下降，溫度58℃時酶活已降至80%以下，70℃已無酶活。市場樣B在40℃～60℃酶活變化很小，然后隨著溫度升高酶活逐步下降，溫度72℃時已降至80%以下。甲公司07年樣品隨著溫度升高酶活逐步下降，溫度64℃時酶活已降至80%以下。

2.4 pH穩定性的研究
經不同的pH條件處理2h后，酶活變化曲線如圖4。
由圖可以看出，康地恩甘露聚糖酶在pH3.0～8.0之間的環境中2h處理后酶活較穩定，一直保持在80％以上；市場樣A在pH小于5.0的環境處理后酶活不穩定，在pH5.0～8.0之間的環境中2h處理后酶活一直保持在80％以上；市場樣B在pH小于4.0時，酶的剩余活力較低，在pH4.0~8.0時酶活基本不受環境影響；甲公司07年樣品在pH小于4.0時，酶的剩余活力較低，在pH4.5~8.0時，酶活較穩定。

3結論
文章通過對康地恩甘露聚糖酶酶學性質的研究分析可以對酶的基本性質有了比較詳細的了解，該酶的最適反應pH為4.5，最適反應溫度為70℃；該酶具有較強的濕熱耐熱性，不同溫度下分別濕熱處理2min及5min后發現在40℃～60℃酶活基本無差異，溫度在76℃以下時保持80%以上的酶活；該酶的pH穩定范圍較寬，經不同的pH條件處理2h后，在pH3.0～8.0之間的環境中酶活較穩定，一直保持在80％以上。這些數據表明該酶具有極佳的適合飼料工業用的酶學性質，酶的活性較高，在飼料工業中有很好的應用前景。
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